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我们的寡核苷酸有多种合成规模、纯化选项和修饰。许多不同的应用需要不同的规模或纯度的定制DNA 寡核苷酸合成,才能很好地工作。点击此处了解如何为您的应用选择最佳寡核苷酸设置。
DNA 合成后,通过在碱性溶液如氢氧化铵中孵育,从固体支持物中释放出完整的 DNA 链。该溶液含有所需的全长寡核苷酸,但也含有在合成过程中中止的所有 DNA 链(失败序列)。如果合成 20 聚体,该溶液还将包含 19 失效聚体,18失效 聚体,17 失效聚体等。存在的失效序列的数量受耦合效率的影响。这些失效序列可以在诸如 PCR 分析中与全长产品发生竞争,因此可能需要在寡核苷酸使用之前将其去除。
纯化方法 | 描述 | 优势 |
---|---|---|
脱盐 ( | 采用正相色谱柱处理寡核苷酸,去除盐但不去除失败序列。 | 即用型无盐 DNA 溶液;适用于许多 PCR 和测序分析,无需进一步纯化。 |
过柱 (50 nm–1 µm, | 基于反相色谱;从完成的合成中去除失败序列。 | 提供某些分析应用所需的全长序列 |
HPLC (50 nm+, | 反相高效液相色谱(HPLC)以与过柱纯化相同的方式去除失效序列或未掺入的标记。 | 保证某些分析应用中需要的高度纯化的引物(> = 85% 全长)。 |
PAGE (200 nm+, | 用于根据大小和构象区分全长产品和失效序列的方法。 | 提供特定应用(例如诱变或接头生产)所需的最高比例的全长寡核苷酸(> = 85%)。 |
分析应用 | 建议的纯化选项 |
---|---|
AFLP 分析 | 脱盐寡核苷酸已成功用于“扩增限制性片段多态性”。 |
反义 | HPLC 纯化的寡核苷酸在反义研究的参考文献中引用最多。有关 HPLC 纯化产量,请参见最低产量表。 |
文库构建中的第一链 cDNA 合成 | 用于文库构建的第一链 cDNA 合成的寡核苷酸通常在末端具有一些编码 5’ 限制性内切核酸酶克隆位点的序列。因此,最好使用全长的,经过过柱、HPLC 或 PAGE 纯化的寡核苷酸。 |
荧光测序 | 所有四种纯度等级都已成功地为科学家们服务。 |
凝胶迁移试验 | 建议将小柱、HPLC 和 PAGE 纯化的寡核苷酸用于凝胶迁移试验,以便获得均一的 DNA 片段群。 |
GENETRAPPER 筛选 | 推荐使用 PAGE 纯化的寡核苷酸。在将其用于 GeneTrapper 系统中的拖尾反应之前,引物应先采用苯酚萃取并用乙醇沉淀。如果购买了脱盐纯度的寡核苷酸,可以使用 PAGE 纯化方案对其进行 PAGE 纯化。 |
恒温测序 | 脱盐寡核苷酸对于该分析来说已经足够,过柱、HPLC 和 PAGE 纯化的寡核苷酸也可以。 |
微阵列 | 标准脱盐寡核苷酸已经足够用于阵列分析。 |
PCR | 脱盐寡核苷酸适用于标准 PCR。更高纯度也可以。 |
5’ 端序列至关重要的寡核苷酸 PCR(例如,限制性内切核酸酶位点,RNA 聚合酶启动子) | 经过柱、HPLC 和 PAGE 纯化的寡核苷酸效率最高。由于寡核苷酸合成是从 3’ 端至 5’ 端,不完整的寡核苷酸(n-x 寡核苷酸)将从 5’ 端序列缺失。使用具有 5’ 端序列的全长寡核苷酸是很重要的,否则在 PCR 反应之前将合成一群缺失序列的 PCR 产物。 |
克隆接头生产 | 全长寡核苷酸最适合有效的克隆。全长引物使用经过柱、HPLC 或 PAGE 纯化的寡核苷酸。 |
定点突变 | 全长(例如,经小柱、HPLC 和 PAGE 纯化的)寡核苷酸通常倾向于提供最高百分比的突变体克隆(尤其是预突变位点在寡核苷酸 5’ 末端附近时)。使用脱盐寡核苷酸可以获得所需的突变。然而,一些野生型亲本载体克隆可能存在残留。 |
回顾我们选择的通用修饰、荧光染料修饰和分子探针染料。注:带星号(*)的修饰名称代表经 HPLC 纯化的产品。
电子订购代码 | 吸收最大值(nm) | 发射最大值(nm) | 消光系数(OD /摩尔)
| |
---|---|---|---|---|
一般修饰 | ||||
醛类 | ALD | NA | NA | NA |
胺(一级) | AMN | NA | NA | NA |
生物素 | BIO | NA | NA | NA |
磷酸盐 | PHO | NA | NA | NA |
硫醇 | THL | NA | NA | NA |
荧光染料修饰 | ||||
荧光素 | FLO | 494 | 520 | 31,500 |
HEX | HEX | 535 | 553 | 31,580 |
ROX* | ROX | 576 | 601 | 22,500 |
TET | TET | 522 | 538 | 16,255 |
TAMRA* | TAM | 565 | 580 | 32,300 |
*这些产品经 HPLC 纯化 |
分子探针染料 | |||||
---|---|---|---|---|---|
染料* | 电子订购代码 | 颜色 | 吸收最大值(nm) | 摩尔发射最大值(nm) | 消光系数
|
Alexa Fluor 488 | 488 | 绿色 | 490 | 519 | 71,000 |
Alexa Fluor 532 | 532 | 绿色 | 532 | 553 | 81,000 |
Alexa Fluor 546 | 546 | 黄色 | 556 | 573 | 104,000 |
Alexa Fluor 555 | 555 | 橙色/黄色 | 555 | 565 | 150,000 |
Alexa Fluor 594 | 594 | 橙色 | 590 | 617 | 73,000 |
Alexa Fluor 647 | 647 | 红色 | 650 | 655 | 239,000 |
Alexa Fluor 660 | 660 | 红色 | 663 | 690 | 132,000 |
Alexa Fluor 750 | 750 | 紫色 | 749 | 755 | 240,000 |
Bodipy FL | BDA | Far Red | 502 | 510 | 82,000 |
Bodipy 530/550 | BDB | — | 534 | 551 | 77,000 |
Bodipy 493/503 | BDC | — | 500 | 509 | 79,000 |
Bodipy 558/569 | BDE | — | 559 | 568 | 97,000 |
Bodipy 564/570 | BDF | — | 563 | 569 | 142,000 |
Bodipy 576/589 | BDG | — | 575 | 588 | 83,000 |
Bodipy 581/591 | BDH | — | 581 | 591 | 136,000 |
Bodipy FL-X | BDI | — | 504 | 510 | 85,000 |
Bodipy TR-X | BDJ | — | 588 | 616 | 68,000 |
Bodipy TMR | BDK | — | 544 | 570 | 56,000 |
Bodipy R6G | BDL | — | 528 | 547 | 70,000 |
Bodipy R6G-X | BDM | — | 529 | 547 | 73,000 |
Bodipy 630/650 | BDN | — | 625 | 640 | 101,000 |
Bodipy 650/665 | BDP | — | 651 | 660 | 100,000 |
Cascade蓝色染料 | CSB | 蓝色 | 400 | 420 | 28,000 |
Marina蓝色染料 | MNB | 蓝色 | 362 | 459 | 19,000 |
Oregon绿 514 | OGB | 绿色 | 506 | 526 | 85,000 |
Oregon绿 488 | OGC | 绿色 | 495 | 521 | 76,000 |
Oregon绿 488-X | OGD | 绿色 | 494 | 517 | 84,000 |
PACIFIC蓝色染料 | PFB | 蓝色 | 416 | 451 | 36,000 |
RGA | 绿色 | 504 | 532 | 78,000 | |
Rhodol 绿色染料 | RGB | 绿色 | 496 | 523 | 63,000 |
Rhodamine绿-X | RGC | 绿 | 503 | 528 | 74,000 |
Rhodamine红-X | RRA | 红色 | 560 | 580 | 129,000 |
Texas红-X | TRX | 红色 | 583 | 603 | 136,000 |
*这些产品经 HPLC 纯化 |
查看可用内部修饰列表及其电子订购代码。
替代碱基 | 电子订购代码 | 描述 |
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Deoxyuracil | U | 与 UDG 一起用于无连接酶克隆。 |
Deoxyinosine | I | Deoxyinosine具有与所有四个碱基进行碱基配对的能力;然而,它具有不同的亲和力。Martin 等人报道了不同组合的稳定性顺序,从最大到最不稳定。 如下面所述:I:C、I:A、I:T 和 I:G。研究发现,I:C 配对比 A:T 配对稳定性稍差(Martin FH,Castro MM 等。(1985)Nucleic Acids Res.13:8927.) |
Phosphothiates | (见下文) | 核苷酸之间磷酸二酯键中的一个氧被硫取代。然后,连接至指定碱基的 3’ 侧。 |
F | ||
C-Phosphorothioate | O | |
E | ||
T-Phosphorothioate | Z | |
混合碱基* | 简并碱基 - 合成仪等量分配指定碱基 | |
A+C+G+T | N | |
A+C+G | V | |
A+T+G | D | |
T+C+G | B | |
A+T+C | H | |
A+T | W | |
C+G | S | |
T+G | K | |
A+C | M | |
C+T | Y | |
A+G | R | |
*对于 50 nmole 及以上规模,可以在任意位置指定混合碱基。对于 25 nmole 规模,除 3’ 端碱基外,可以在任意位置指定混合碱基。通过使合成仪在指定碱基添加的情况下等量分配的每种碱基来获得混合碱基。耦合效率的差异可能导致最终产品略微偏向于以最高效率耦合的碱基。 |
仅供科研使用,不可用于诊断目的。