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为帮助您优化自己的实验，获得最理想的结果，我们在此针对您的研究需要，编制了一个涵盖常用注意事项和诀窍的资料库。
详见下文提到的相关问题。
您的实验遇到麻烦了？敬请访问我们的
| 反转录酶 | 优势 | 劣势 |
|---|---|---|
| AMV（禽成髓细胞瘤病毒） | 在55°C下具有活性 | 带有RNase H酶活性，影响全长cDNA的得率 |
| M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒） | 相对于AMV，RNase H活性较低 | 在温度超过45°C的条件下会失活 |
| Thermoscript™ | 高热稳定性（最高可承受65–70°C） 提高了易成二级结构RNA的得率 可产生更多的全长cDNA（较低的RNase H活性） 增强了引物结合特异性的AMV突变体 | 在-80°C条件下储存；存储不当时，会很快失去活性 |
| SuperScript II | 较高的第一链cDNA得率 较高的全长cDNA合成率 具有TdT活性的M-MLV突变体 | 理想的温度是42°C；高温下不稳定。 |
| SuperScript III | 具有最高的第一链cDNA得率 最高的第一链cDNA得率 具有最高的全长cDNA合成率 可使用较高的活性单位，不会抑制随后的PCR反应 相对于 SS II ，具有更长的热稳定性 在50°C具有活性的M-MLV突变体 |
MultiScribe™ 反转录酶（货号4311235）和MuLV反转录酶（货号 N8080018）基本上算是同一种酶，都属于重组莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)反转录酶。二者唯一的区别在于推荐的用途。MultiScribe™反转录酶推荐用于定量核酸分析，而MuLV则推荐用于传统的RT-PCR分析。
是的，我们的确供应 SuperScript CellsDirect™ cDNA合成试剂盒，该试剂盒适用于单个细胞至10,000个细胞。此试剂盒还可用于冰冻切片激光显微切割（LCM）样品，但甲醛固定石蜡包埋的组织（FFPE）不能使用。此外，您还可使用我们的Ambion Cells-to-CT™试剂盒，该试剂盒可自细胞裂解液直接进行RT-PCR扩增。这些试剂盒均与培养的细胞和LCM样品兼容。
SuperScript VILO™ cDNA合成试剂盒含有SuperScript III反转录酶和辅助蛋白的混合物，其中后者可以提高反转录反应的效率，进而提高得率。由于存在辅助蛋白，SuperScript VILO™中的反转录在42°C条件下活化。
在-20°C非无霜冰箱储存时，M-MLV反转录酶、SuperScript II反转录酶和SuperScript III反转录酶可在2年内保持稳定。在4°C 条件下，这些酶可在48小时内不失活。但需要新鲜的DTT来维持活性。
SuperScript III反转录酶最适温度是50°C，其适用的最高温度为55°C。在部分使用基因特异性引物的qRT-PCR反应中，您可以在60°C下进行反转录反应。SuperScript II反转录酶最适温度是42°C，其适用的最高温度为50°C。M-MLV反转录酶最适温度是42°C。ThermoScript™反转录酶在60°C下表现出最佳的活性，其适用的最高温度可达70°C（适用于扩增子长度预计为1kb或更短的情况）。对于预期PCR产物长度超过1kb的情况，建议采用的最高的第一链合成温度为60–65°C之间。特别是当基因特异性引物配合使用热稳定性反转录酶的情况下，务必要保证您的第一链引物在较高温度下退火，。。用上述酶进行反转录时，若使用oligo(dT)引物进行第一链合成，我们建议使用oligo(dT)25。
不会，如果需要有TdT活性的酶，请使用SuperScript II反转录酶。
SuperScript III反转录酶（货号18080093、18080044、18080085）含有单独的酶，5 X第一链缓冲液和100 mM DTT。
用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统是一个完整的试剂盒，包含SuperScript III反转录酶，以及从总RNA或poly(A)- RNA合成第一链cDNA所必需的其他成分，其中包含：建议使用酶附带的缓冲液。之所以出现这些细微的差异，是因为不同的试剂盒开发时间不同，并且很可能由不同的研发团队开发。
不会。在加入EDTA后， Mg2+:EDTA的摩尔比约为1:1。EDTA会与Mg2+按照1:1的摩尔比例进行螯合。因此RNA可以直接用于反转录。第一链反转录缓冲液的Mg2+终浓度通常为2.5mM。 如果反转录反应缓冲液中不含MgCl2，则可向反应体系中添加终浓度为2.5 mM 的MgCl2 。因此会使MgCl2的净终浓度约为2.25-2.5 mM。
可以从附着在Dynabeads磁珠上的mRNA生成全长cDNA。我们建议您在此时采用热稳定的反转录酶试剂盒，以适应富含GC二级结构的难处理区域。即便如此，仍不可在实验开始时加热磁珠上的mRNA，因为这会造成mRNA洗脱（A:T碱基对是热稳定性最差的）。
我们内部曾以磁珠上的oligo(dT)25为引物，使用了ThermoScript™反转录酶。其中的cDNA合成过程依照说明书进行。在使用热稳定的反转录酶和oligo(dT)25引物进行第一链cDNA合成时，在进行建议的更高温度处理之前，必须先在50°C下进行5分钟的孵育。这是为了让cDNA合成至AT杂交区域之外以增加结合稳定性，从而确保mRNA不会从磁珠上脱落。最终的cDNA会共价结合到磁珠表面，且结合有cDNA的磁珠可用作多种杂交反应的模板。
此操作步骤（65°C下加热5分钟）的目的在于打开RNA中的二级结构。如果您希望将磁珠上的oligo(dT)25用作您的cDNA合成引物，生成连接在固相支持物上的cDNA，就可以忽略这一步。此时您可从50°C开始（否则mRNA会从磁珠上脱落），然后进入65°C处理步骤。
以下成分可单独购买：
可以。我们单独出售 的M-MLV反转录反应缓冲液（货号18057018），可以用于M-MLV反转录酶、SuperScript II反转录酶和SuperScript III反转录酶。
可以。我们的确单独出售随机引物，其货号为48190011。
是的，我们单独供应大肠杆菌RNase H酶，其货号为18021014和18021071。
这些酶均含有RNase H结构域，但是这些RNase H结构域都经过突变。在RNase H活性检测分析之中，我们未检测到任何RNase H活性。
以下试剂至少可将SuperScript II反转录酶的活性抑制50%。
设置一组未进行反转录的RNA作为对照以检测特异性。如果这一RNA产生了PCR产物，其最可能由基因组DNA污染物产生。此外，可横跨两个外显子设计引物对，从而确保来自cDNA的PCR产物可以与基因组cDNA生成的产物在大小上有明显的区别。在设计引物时，也可以在跨越外显子/外显子的结合部位设计。这些引物不大可能以基因组DNA为模板扩增。使用DNase处理RNA时，建议使用扩增级DNase I（货号18068015）或等效的产品。
不能再用了，必须更换DTT。
当然，为此我们提供了三种试剂盒：
一步法RT-PCR相对方便，不易污染，且移液错误的机会较小。这种方法要比两步法速度更快。然而，这种方法生成的cDNA不可保存，而且每次只能分析少量的基因。两步法可以获得可保存的cDNA，同时可分析多种基因，具有较大的灵活性。
对于降解的RNA、含有严重的二级结构的RNA、无polyA尾的RNA或原核RNA，随机引物是最佳选择。随机引物仅推荐用于两步法RT-PCR，而且通常可以获得最高的得率，尽管cDNA可能不为全长cDNA。如希望通过两步法RT-PCR得到全长cDNA时，最好使用Oligo(dT)引物。这一反应受到二级结构和RNA质量影响。基因特异性引物应用于特异性基因的扩增反应，主要用于一步法RT-PCR反应。
这很大程度上依赖于样品的质量。mRNA占总RNA的1–5%。根据所用的引物和酶，反转录反应可以将>70%的RNA转换成cDNA。
有些人觉得，反转录之后形成的RNA:DNA双链之中的RNA会抑制PCR引物退火和扩增cDNA。使用RNase H-的突变体反转录酶时，RNA仍然存在。RNase H可以去除与cDNA结合的RNA。但另一方面，有些人认为95°C的变性步骤会造成RNA引物与DNA脱离，因而RNase H处理完全没有必要。因此这一步骤是可选的。在克隆较大的片段时，RNase H处理的做法较为有益。
cDNA合成所需的RNA模板量具有高度的灵活性，取决于可用的样品量和个人需求。通常情况下，1 μg总RNA可进行一次常规20-μL反转录反应。
具体的体积取决于用于第一链合成的起始RNA量，以及靶标基因的丰度。我们建议在50-μL的PCR反应中，以10%第一链合成反应的量作为起始用量，超过10%将会抑制下游反应。
采用不含RNase的DNase处理RNA可以将DNA的含量控制在检测不到的水平。我们建议使用我们的扩增级产品DNase 1（货号18068015）。
我们建议采用 Purelink RNA Mini Kit （货号12183025）或TRIzol试剂（货号15596026）来分离RNA。通常没有必要采用Oligo(dT)法选择性分离mRNA，尽管这能够提高特异性cDNA的得率。
建议您使用我们的ThermoScript™ 反转录酶，在如今市售的反转录酶之中，这种酶具有最高的热稳定性，可以处理您的较棘手模板（高GC含量或过多二级结构）。
该抑制剂可以防止在RNA准备过程中由于核糖核酸酶污染引起的靶RNA的降解。
如果在不含反转录酶的对照管/孔中生成扩增产物，必须从RNA样品中去除残留的基因组DNA。您可通过下述实验方案从总RNA中去除基因组DNA。
在冰上，将以下成分添加到无菌的 0.5 mL微量离心管中：
请留意以下注意事项：
在加入EDTA后， Mg2+:EDTA的摩尔比例约为1:1。EDTA会与Mg2+分子按照1:1的摩尔比例进行螯合。因此，该RNA可直接被用于下游的反转录反应。加入第一链反转录酶缓冲液会使镁离子的终浓度为2.5mM。如果反转录反应缓冲液中不含MgCl2，则可向反应系统中添加MgCl2直至其终浓度达到2.5 mM。这样MgCl2的净终浓度约为2.25-2.5 mM。
RNA水解参考文献：
Molekulyarnaya Biologiya (1987) 21:1235-1241.
References on the mechanism of hydrolysis by other cations:
Eichorn GL and Butzov JY (1965) Biopolymers 3:79.
Butzov JY and Eichorn GL (1965) Biopolymers 3:95.
Farkas WR (1968) Biochim Biophys Acta 155:401.
第一篇论文的作者表达了这样一种观点，即由于阳离子引起的非特异性水解（通过2'，3' 磷酸环化进行）类似于RNA剪接时发生的特异性水解。
RACE的含义为cDNA末端快速扩增技术。这是一种发现全长转录本的5′和/或 3′末端的方法。如果您所感兴趣的转录本的局部序列已知，可采用RACE技术获得完整的ORF、5′ UTR和3′ UTR序列。
在核查RNA的完整性时，对500 ng的RNA通过琼脂糖/溴化乙啶凝胶电泳方法进行分析。您可以使用常规的1%琼脂糖凝胶或者变性的琼脂糖凝胶。对于总RNA样品，您应观测到 28S和18S的 rRNA条带。 mRNA会形成0.5至12 kb的拖尾。 28S条带的强度应为18S条带的两倍。如果您上样的RNA不足，则28S条带可能显示为弥散状态。如果使用变性的凝胶，则rRNA条带会非常清晰且尖锐。28S条带对应于4.5 kb，而18S条带对应于1.9 kb。
如果您进行5′ 端或3′端RACE，则需要一条基因特异性引物；如果您同时进行5′ 端和3′端RACE，则需要两条基因特异性引物。引物应符合下述规定：
如果该反应能够得到特异性的产物且对照反应没能得出特异性产物，则您的条带很可能是真实的。唯一的确证方法是对产物进行测序。
如果该反应能够得到特异性的产物且对照反应没能得出特异性产物，则您的条带很可能是真实的。唯一的确证方法是对产物进行测序。
可变剪接或可变polyA位点以及可变的起始位点都会产生正常的多个条带。进行测序有助于帮助您解决不确定性问题。
以下为几条有助于您优化自己的RACE反应的建议：
3′端RACE利用了mRNA中自带的poly(A)尾作为通用的PCR反应的起始位点。在这一操作步骤中，mRNA通过反转录酶(RT)和oligo-dT接头引物反转录成cDNA。特异性的cDNA随后通过PCR反应，采用基因特异性引物（GSP，退火到已知外显子序列的区域）和接头引物（靶向poly(A)尾区域）进行扩增。这样一来，即可捕获处于外显子和poly(A)尾之间的未知的3′-mRNA序列。
CIP酶不能识别三磷酸核苷酸。如果您的产物的末端具有除单磷酸基团之外的其他修饰，CIP均不会对其进行去磷酸化，而且在实验方案的后续步骤之中RNA连接酶也不会将RNA寡核苷酸结合到5′端三磷酸上。如果为了获得全长的带帽的信使RNA而遵照随附的实验方案操作，则不能从5′端三磷酸化的RNA材料获得任何产物。
接头引物(AP)、通用扩增引物(UAP)和精简的通用扩增引物 (AUAP)已经停产。其序列可见本手册第4页。
5’端RACE精简锚定引物 (AAP)、通用扩增引物(UAP)和精简通用扩增引物(AUAP)已经停产。其序列可见本手册第4页。
巢式PCR需要进行两轮扩增 – 第一轮扩增使用一套PCR引物，第二轮扩增则使用内部的“巢式”引物和1%或者更少的第一次PCR反应产物作为模板。当靶标丰度较低或同时产生特异性和非特异性PCR产物时，可以使用巢式PCR。如果序列信息只能在第一轮PCR产物的内部设计出一端的引物（如在RACE中），则需要使用半巢式PCR。
仅限研究用途，不得用于诊断操作。