反转录反应及RACE支持——故障排除

以下列出了各种原因和我们提供的建议：

Please see the following causes and suggestions:

cDNA得率低可能由不同的原因造成。以下列出了几条：

• mRNA质量不佳：在变性凝胶上对总RNA进行观察，以确认28S和18S条带是否清晰明亮。OD 260:280比率应为1.7。
• RNase污染造成模板降解：保持无菌条件。
• 可能存在SuperScript II反转录酶的抑制剂：在第一链反应之前，通过对mRNA进行乙醇沉淀来去除抑制剂。加入70%（体积比）乙醇对mRNA沉淀进行洗涤的步骤。若需验证是否存在反转录酶抑制剂，可以在反应体系中加入1 μg的对照RNA比较第一链cDNA合成的得率。
• RNA产物可能与多糖共沉淀：采用氯化锂沉淀RNA，纯化RNA。
• 高估了mRNA的浓度：如有可能，测定A260，对mRNA浓度进行定量分析。
• 如果使用32P同位素，其可能放置的时间太久：请使用时间不超过2周的同位素。
• 酶的量不足：针对每μg RNA推荐使用200 U的SuperScript II反转录酶。
• SuperScript II反转录酶的活性因反应温度不当而降低：请在37°C至50°C条件下进行第一链反应。
• 第一链反应体系中未添加了DTT。
• TCA沉淀操作不当 ：在浸入液闪剂之前充分干燥GF/C滤网。
• SuperScript II反转录酶存储不当。请在-20°C条件下储存，请勿在-70°C条件下储存。
• 反应体积过大：反应应在小于或等于50 μL的体积下进行。

我们分析的原因和建议如下：

• 第一链合成产物浓度过低：起始RNA的质量过低，反应体积过大，且/或引物浓度过低或引物未针对RNA正确退火。
• 第二链合成产物浓度过低：未加入RNAse H，或者在进行第二链反应时进行了不当稀释。
• 克隆数量过少：最可能是接头连接/磷酸化时出现问题；请使用phiX Hae III片段作为对照；为其连接接头并进行磷酸化处理，以判定这一环节是否存在问题。

我们分析的原因和建议如下：

• 检查HeLa对照RNA：RNA降解或者 PCR或反转录反应失败都可能造成无RACE PCR 产物。
• 您的基因丰度可能过低：请增加PCR循环的数目或者进行巢式PCR。
• 您的基因未在这一组织中表达：通过两种GSP进行扩增，以便分析您的基因的cDNA是否存在。
• 反转录反应未能生成您的基因的cDNA：采用随机引物或GSP（在尽可能靠近5’端的位置杂交）进行反转录反应；此外，您还可将随机引物和GeneRacer Oligo dT引物联用，以增加获得全长cDNA的几率。
• cDNA模板对于PCR反应属于困难模板：优化PCR反应参数和/或反应缓冲液；降低退火温度；在PCR反应中使用5-10% DMSO以帮助扩增GC含量高的区域；尝试高持续合成能力、高保真度的PCR反应酶。
• 在PCR反应后观测不到条带：试试其它退火温度。
• RNA质量：在开始实验前，在琼脂糖凝胶上分析您的RNA样品。

形成RACE PCR假象或者非特异性的PCR条带的原因可能有如下几条：

• GSP与其它cDNA非特异性结合，从而造成非相关的产物和所需的产物一同扩增。
• GeneRacer引物与cDNA非特异性结合，从而形成了两端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
• RNA降解。
• PCR管或试剂被污染。

注：假象可能由于未处在最佳的PCR反应条件造成，此类情况可通过阴性对照PCR鉴定出来。

取10-20个克隆集落进行分析，以确认分离出了最长的转录本。很多基因并不仅含有一套转录起始位点，而是有多个转录起始位点，而且这些位点有时候只跨几个碱基，有些时候可能跨上百个甚至更多个碱基。对RACE产物进行克隆，同时分析多个克隆集落，可确保您能够检测出您的基因中的多种异质性转录起始位点。此外，您可能得到非全长基因转录本的PCR产物。之所以可能会获得非全长信使RNA的PCR产物，是因为：

• CIP反应之后RNA降解，而形成了带有5’端磷酸基团的非全长RNA，进而得以连接到 GeneRacer RNA寡核苷酸上。请务必谨慎处理，以确保RNA不会降解。
• CIP去磷酸化不完全。请通过增加CIP的用量，或减少RNA量来解决。
• PCR反应出现了PCR非特异性条带，未能得到真正的连接产物。请采用上述优化您的PCR条件。

以下为有助于获得最佳的实验结果的几点因素：

1. 保证成功的关键因素是确保RNA的质量。RNA降解是未能获得正确的RACE产物的最可能原因。我们强烈建议您在开始实验前在琼脂糖凝胶上分析您的RNA样品，以确认RNA的完整性。使用RNaseOUT™ RNase抑制剂可以确保不同的酶促反应期间RNA的稳定性。如果您对RNA稳定性特别关心，可以在各个酶促反应（CIP、TAP和连接反应）之后使用琼脂糖电泳方法进行检测。在适当体积的酶促处理之后，采用DEPC水重悬RNA（参见 GeneRacer 试剂盒手册第7、9和11页），选取1 μL在琼脂糖上进行分析。与等量的未处理RNA进行比较，以检查降解情况。
2. RACE PCR假象或者非特异性条带可能由于以下几点原因造成：
   • GSP与其他cDNA非特异性结合，从而造成非相关的产物和所需的产物一同扩增。
   • GeneRacer引物与cDNA非特异性结合，从而形成了两端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
   • RNA降解。
   • PCR管或试剂受到污染。

   注：假象可能由于未处在最佳的PCR反应条件造成，此类情况可通过阴性对照PCR鉴定出来。

3. 如果可以看到 GeneRacer 5′ 端引物对照存在拖尾，我们的建议如下：
   • 使用其它5′ 端引物（所谓的GeneRacer 5′端引物）。与原引物相比，其与RNA寡核苷酸的结合位点略有差异，但相对于原始的5′ 端引物，其通常具有更低的背景。以下为GeneRacer 5′端引物的序列：5′ GCACGAGGACACTGACATGGACTGA。这一引物可在5′端RACE PCR之中，取代原始的5′端引物合成和使用。其应当能够降低RACE PCR的背景。
4. 如果您使用5′ 端引物进行阴性对照实验时发现了拖尾，而另一阴性对照（无模板、含模板及GSP）表现正常，同时所有反应具有相同的PCR条件，那么：
   • 如果您使用5′ 端引物和模板时出现背景，则您应该从实际的RACE反应中去除这些条带/拖尾，以免与真实的RACE条带形成混淆。由于每一cDNA均具有该引物的结合位点，因而阴性对照之中始终存在这些拖尾。因此，这些拖尾现象不应成为主要关注的问题。如果实际上RACE PCR正常，则RACE条带的强度会超过拖尾背景。

巢式PCR如不经过优化，可能不产生条带，生成单条或者几条条带，或者出现混杂的条带（拖尾）。拖尾或扩增失败是由RNA质量不佳、RLM-RACE使用的RNA内缺少靶标造成。请务必使用纯净、优质的RNA作为您的起始材料。

• 由于靶标基因具有多个起始转录位点或者引物同源性很高，可能会出现多条条带；您可以试试一套新的引物。如果您正在使用内部和外部基因特异性5′ 端RLM RACE引物（适用于巢式PCR），可试试在PCR反应之中将他们分别与基因特异性5′ 端引物配合使用，并等量稀释反转录反应产物作为模板。
• 使用非TAP处理对照；非TAP处理的对照RNA应和您目前实验的RNA获得不同的PCR产物。由于RNA要么通过CIP脱磷酸，要么具有无法连接到5′端RACE接头的完整带帽结构，因此不会产生条带。
• 优化PCR退火温度；外部PCR的退火温度不太关键，应保持在55–65°C；而内部的巢式PCR退火温度则可能需要更高，以便实现必需的扩增选择能力。如果PCR无法给出预期的结果，则可升高退火温度（试试提高2°C）再次试验。
• 如果您的靶标较长，可以针对超过1kb的靶标延长扩增循环，每kb长度延长1分钟，
• 如果您的RNA转录本之中含有高GC含量区域和/或其他具有稳定的二级结构的区域，可以试试升高反转录反应的温度，以便最大限度减少二级结构造成的影响。试剂盒中所含的M-MLV反转录酶可以在高至50°C的条件下使用。升高合成反应的温度，可能促进反转录酶通读。