T細胞受容体活性化Ca2+チャネルのクローニング

Introduction
Activation of T lymphocytes is critical for a successful immune response. 独自のT細胞受容体（TCR）を通じて個々のT細胞に認識された病原体は破壊され断片化されます。 この認識によってT細胞の活性化と拡大が始まり、最終的に病原体の破壊へとつながります。 これらの現象は、TCRを介して伝達される、細胞質内遊離Ca ²⁺濃度を増加するシグナルに依存しています。 Ca ²⁺は細胞内の貯蔵部位から最初に放出され、その後Ca ²⁺の流入が起こります。 T細胞が活性化するためには、少なくとも2時間Ca ²⁺流入を維持する必要があります。 This is thought to occur through Ca ²⁺-release activated Ca ²⁺ (CRAC) channels.

The molecular identity of CRAC channels is still unknown, although TRP channels and CaT1 are candidates in some cells. In an attempt to clone the T lymphocyte CRAC channel we have focused on conserved regions of Ca ²⁺ channels. これまでの研究により、従来のL型Ca ²⁺チャンネルの制御因子はTCRを介するCa ²⁺応答に影響を及ぼすことが明らかにされています。

Given the estimate of only a few hundred CRAC channels per T lymphocyte we anticipated a low abundance of mRNA for the protein. チャンネルのクローニングを行うためには、迅速で感度の高い分離方法により精製した完全長mRNAサンプルが必要となります。 Dynabeads®を用いてそのような分離方法が可能であり、Dynabeads®は再利用が可能であるため、経済的にも優れています。

Methods and results
Magnetic mRNA isolation
Jurkat T lymphocytes (20 x 106) were first washed with PBS, pelleted and lysed with 5 ml Lysis/Binding Buffer. ライセートを21ゲージ針に数回通して、細胞由来のDNAを剪断し、粘度を下げたライセートを生成しました。 Dynal MPC®マグネットを使用して、以下の Dynabeads®製品の説明書に従ってmRNAを分離しました。 mRNAの溶出後、ビーズを再生し、さらにmRNAの分離に再利用しました。

RACE-PCR
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a method for amplification of a mRNA template between a defined internal site and an unknown sequence at either the 3’ or 5’ end. 3’ RACE takes advantage of the natural polyadenylated tail of mRNA as a generic priming site and uses an adaptor primer targeted to this region. リンパ球Ca ²⁺チャネルを試験するための薬理学的ツールを用いたこれまでの研究から、このCa ²⁺チャネルのクラスの領域が高度に保存されるように、PCRプライマーを設計しました。 Sequencing of the PCR product revealed it to be an L-type Ca ²⁺ channel, and gene specific primers were designed for RACE-PCR. 1 microgram of the isolated mRNA was used to create 3' RACE first strand cDNA, and two rounds of 3' RACE were performed. PCR産物をゲル電気泳動法により分析しました（図1）。 DNAの突出したバンドをゲルから切り取り、精製しました。 pGEM-T Easy vectos system ii（Promega）を使用してクローニングを行い、プラスミドをシークエンシングしました（MWG Biotech）。

Conclusions and future work
Analysis of the sequence revealed the Ca ²⁺ channel to be an alternatively spliced form of the cardiac L-type channel (Cav1.2). Future work will involve studying the expression of the Ca ²⁺ channel in a range of hematopoietic cells, the electrophysiological properties of the Ca ²⁺ channel, and the signalling pathways that regulate its expression.


参考資料

1. Grafton G, Thwaite L, Wilkinson B, Toellner KM and Gordon J. A non-voltage-gated calcium channel with L-type characteristics regulates antigen receptor-signalling in Group I Burkitt lymphoma cells. In Prep. 2001.
2. Fomina et al 2000, Single channel properties and regulated expression of Ca²⁺ -release activated Ca²⁺ (CRAC) channels in human T cells. J. Biol. Chem 150: 1435-1444.
3. Frohman, M.A. 1990. PCR protocols: A guide to Methods and Applications (Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J. eds.)
4. Yue et al, 2001. CaT1 manifests the pore properties of the calcium-release-activated calcium channel. Nature 410: 705-709.
   

論文は Leanne Thwaite, Gillian Grafton and John Gordonによる。 MRC Centre for Immune Regulation, University of Birmingham, The Medical School, Vincent Drive, Birmingham B15 2TT, UK. E-mail: LMT860@bham.ac.uk