抗体産生（免疫原調製）

抗体産生の概念はシンプルです。しかし、抗体産生は非常に複雑な生体システム（生体免疫）に依存するため、完全に結果を予測することは不可能です。個々の動物（遺伝的同一性の動物も含む）は、同じ免疫計画に対してそれぞれ独自に応答し、注入抗原に対して種々一連の特異的抗体を産出します。その一方で、注入異物に対する免疫系応答方式の基本原理を理解して、注入サンプル調整に利用できるツールを把握することにより、研究者は有用な抗体生成物を一段と得やすくなります。

例えば、低分子化合物（薬物またはペプチド）自体は、十分な複雑性を備えていないため、免疫応答を誘発できず、また特異的抗体を産出させる方法で処理できません。小さな抗原から抗体を産出させるには、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などのキャリアタンパク質へ抗原を化学結合させる必要があります。アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が高まります。

キャリアタンパク質結合、アジュバントの使用法、注入サンプル調製の関連問題については、抗体産生に関する本項にてご紹介いたします。抗原特異的プローブとして用いる抗体の生成、精製および修飾の手順は、1970年代から1980年代に開発されました。そして、1988年にHarlow氏およびLane氏により名書「Antibodies: A Laboratory Manual（抗体：ラボマニュアル）」が出版されて以来、本手順はほとんど変化していません。

免疫系は、外来侵入物から宿主を保護する役割を果たす監視システムです。この監視を媒介するタンパク質および細胞は、生物体全体を循環して、外来性の細胞やウイルスまたは巨大分子を特定し破壊します。

免疫防御は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答による二重方式で達成されます。細胞性免疫応答は、Tリンパ球に媒介され、血清の輸血による個体間の移植はできません。体液性免疫には、血清の輸血時にレシピエントへ移植される血清（抗体）中に観察される可溶性タンパク質が関与します。

脊椎動物中の細胞は、細胞膜上にクラスI主要な組織適合性複合体（MHC I）を必ず発現します。MHC Iは、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）に内因的誘導されたペプチド抗原を提示します。CTLのT細胞受容体が細胞上のMHC I/ペプチド抗原に結合すると、全細胞が破壊されます。これは、ウイルスまたは細菌（非自己型）および癌細胞（改変自己細胞）などの細胞内病原体を標的とする細胞性免疫応答について一般的に言えます。

体液性応答は、細胞外抗原を標的とします。Bリンパ球は、メンブレンIgM (mIgM)を用いて、その天然形態で抗原へ結合します。多数のmIgMと抗原分子の架橋が発生（キャップ形成）した後、複合体は受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞へ取り込まれます。そして、このエンドソームがリソソームと融合して得られるエンドリソソームは、抗原を小ペプチドへ消化させます。エンドリソソームは、クラスIIの主要組織適合遺伝子複合体（MHC II）分子を含有する小胞と融合し、ペプチド抗原はMHC II中の間隙に結合されます。その結果、このMHC II/抗原複合体は、Bリンパ球の細胞膜上に発現されます。その後、ヘルパーTリンパ球のT細胞受容体はMHC II/抗原と結合します。T細胞は、Bリンパ球へシグナルを送るサイトカインを分泌することにより、抗体を分裂、分化、分泌させます。ヘルパーT細胞が無いと、体液性応答は停止します；実際は、AIDSと同様に細胞応答もシャットダウンします。

ヘルパーTリンパ球に対して抗原を結合・処理・提示するBリンパ球は、抗体生成を達成させる上で重要な要素となります；ヘルパーTリンパ球は、抗体を生成・分泌させるシグナルをB細胞へ送ります。抗原とは、免疫系成分によって非自己型として識別されるタイプの分子です。免疫原とは、体液性応答を介した抗体産生を含む、免疫応答を誘発する能力のある抗原です。全ての免疫原は抗原である一方、抗原の全てが免疫原であるわけではありません。化合物の多くは免疫原性でないため、「抗原」と「免疫原」の用語をそれぞれ区別することが重要です。また、こうした抗原に対する抗体産出を達成するには、抗原を注入する前に既知の免疫原性へ化学結合させて、抗原を免疫原性化させておく必要があります。

免疫原性とは、分子による免疫応答の誘発能力を指します。物質の免疫原性が求められる特性には、異質性、高分子量、化学的複雑性の3要素が存在します。免疫動物が物質を「自己」として認識して無視しないように、異質性が求められます。一般的に、生物由来の化合物は、同一個体に対する免疫原性がなく、同種または関連種の別個体に対してわずかな免疫原性があるばかりです。

免疫原性の第2要件は、高分子量性です。ペニシリン、プロゲステロン、アスピリンなどの低分子化合物（分子量1000未満）、ならびに様々な中サイズ分子（MW：1000〜6000）は、免疫原性がありません。分子量6,000以上の化合物の大半は、免疫原性があります。これ以下の化合物は、通常Bリンパ球の表面上のmIgMにから結合され得ますが、サイズが小さすぎるためmIgM分子の架橋を促進することはできません。この架橋は、一般に「キャップ形成」と呼ばれ、抗原の受容体媒介性エンドサイトーシスへのシグナルとなります。

結論として、化合物が免疫原性であるためには、ある程度の化学的複雑性が求められます。例えば、高分子量のホモポリマーアミノ酸や単純な多糖類でさえも、免疫応答の生成に必要な化学的複雑性が不足しているため、優れた免疫原を生成しません。

高分子の主要4クラス（炭水化物、脂質、核酸、タンパク質）の免疫原性に関してある程度の一般原則があります。炭水化物は、比較的複雑性の高い多糖類（糖タンパク質など）の構造または形態を部分的に有する場合に限り、免疫原性があります。脂質は、通常免疫原性がありませんが、キャリアタンパク質へ結合させることにより免疫原性化できます。同様に、核酸は免疫原性が非常に低いですが、キャリアタンパク質に結合されると免疫原性化されます。

タンパク質は、その特有の構造複雑性とサイズが要因で、一般に強力な免疫原となります。天然性免疫原の大半はタンパク質や炭水化物から成る高分子であることを考えれば、タンパク質が広範に免疫原性であるのは至極当然と言えます。天然性免疫原の大半はタンパク質や炭水化物から成る高分子であることを考えれば、タンパク質が広範に免疫原性であるのは至極当然と言えます。ペプチドは、抗体の免疫応答と産生を確実に誘発させるため、主にキャリアタンパク質へ結合されます。

抗原として用いられるペプチドおよび小分子類は、ハプテンと呼ばれています。これらは特異的抗体の産生において認識部位として作用し得ますが、これら単独では所要の免疫応答を刺激することができませんハプテンは、適正なキャリア分子へ結合させることにより、免疫原性化されます。

エピトープは、抗体が結合する抗原上の特定部位です。微細な抗原については、化学構造全体が実質的に単一エピトープとして作用することがあります。抗原は、それぞれの複雑性とサイズに応じて、多数のエピトープを標的とした抗体産生に影響を及ぼすことがあります。ポリクローナル抗体は、血清免疫グロブリンの混合物であり、抗原上の多数のエピトープへ集団的に結合する傾向があります。モノクローナル抗体は、定義上、単一の抗体クローンのみを指し、一つの特定エピトープに対して結合特異性を有しています。

化合物が免疫原性形態で免疫系へ提示される限り、十分な独自性を備えたあらゆる構造（天然または合成問わず）に対して特異的抗体を生成できます。得られた抗体は、全分子（例：小ハプテン）から成る、特に次のようなエピトープへ結合します：より大きな分子の特定官能基；タンパク質三次構造中の各アミノ酸官能基の独自配列；リポタンパク質、糖タンパク質、RNA、DNA、多糖類などにおける独自構造。また、エピトープは細胞構造、細菌、真菌またはウイルスの一部である場合があります。

キャリアタンパク質とは、サイズや複雑性が十分でないため免疫応答を誘導して抗体を産生できないペプチドやハプテン類との結合に用いるタンパク質です。キャリアタンパク質は、サイズが大きく複雑性を備えているため共役ハプテンへ免疫原性を与えます。その結果、 抗体がハプテン上およびキャリア上のエピトープに対して産生されます。様々なタンパク質がキャリアタンパク質として使用できます。免疫原性や溶解性に応じて、さらにハプテンとの結合が達成できる有用な官能基の可用性に応じてタンパク質を選択します。主要な2大キャリアには、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）とウシ血清アルブミン（BSA）が挙げられます。

標準的な免疫応答において、抗体はBリンパ球により産生されますハプテン-キャリアシステムの大半で、B細胞は、ハプテンおよびキャリアのいずれにも特異的な抗体を産生します。抗体応答は、キャリアタンパク質上およびハプテン上の両エピトープに対して起こるため、最終免疫化された血清からハプテン特異的抗体を同定および精製するプロセスについて入念に計画する必要があります。最良の免疫原を作製するには、ハプテン-キャリア結合比の範囲内で数種類のキャリアとの結合体を調製するとよいでしょう。

キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）は、最も一般的に使用されているキャリアタンパク質です。銅含有ポリペプチドは、節足動物や軟体動物中に観察されるヘモシアニンと呼ばれる非ヘムタンパク質群に属します。KLHはキーホールリンペットから単離されています(メガトゥーラ クレヌラータ)。

KLHは、タンパク質クラスや、哺乳動物から進化的に離れた生物群に由来するため、一般的に抗体産出に用いられる動物系にとっては「外来性」が高くなります。タンパク質は、大きなサイズと複雑な構造性を備えているため、高い免疫原性があります。分子は、350 kDaおよび390 kDaのサブユニットから構成されています。これらのサブユニットが会合することにより、0.5～800万ダルトン範囲で凝集体が形成されます。

各KLHタンパク質分子に含まれる数百の表面リジン基は、様々な架橋法を用いてハプテン共有結合の標的として第一級アミンを供給します。こうした機能により、KLHは免疫原性が極めて高く、免疫原調製に有効なキャリアタンパク質となります。大きなタンパク質は、溶解度が限られているため、取り扱いにくい場合がありますが、安定化・予備活性化済みの市販製剤を利用すると、これらのタンパク質を活用しやすくなります。

Thermo Scientific Imject Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin (mcKLH)は、精製済み形態で、安定化バッファ中で凍結乾燥されています。再構成後の懸濁液は、高精製済みの非変性KLH特有の、乳白色ブルーです。

従来KLHは、自然環境から直に採取した巨大なキーホールリンペットから取得されていました。この取得方法が原因で、キーホールリンペットが生息する繊細な海岸生態系が乱されます。現在のKLH取得法では、自然生息地やキーホールリンペットの生存が脅かされる事態はほぼ発生しません。巨大なキーホールリンペットはタンク内で養殖され、回収されます（海洋養殖）。人間における献血同様に、時折カサガイの体液の適量が搾取されます。

Blue Carrier* Proteinは、ロコガイヘモシアニン（CCH）の精製済み製剤です。大きなタンパク質は、需要の高いキャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）とほぼ同じ免疫原性特性を示します。しかし、溶解性が極めて高いことから、架橋法によるペプチド、タンパク質、ハプテン類の結合のバッファ条件およびpH条件が拡張されるため、免疫原調製プロトコルの柔軟性がさらに高まります。

Blue Carrier Proteinは、軟体動物ロコガイから特殊精製されたヘモシアニンです。CCHタンパク質は、2つの極大ポリペプチドサブユニット（404 kDa および351 kDa）であり、二価カチオンの非存在下で安定性の非常に高いヘテロ二構造を形成します。（対照的に、KLHは安定性と可溶性の非常に低いホモ二量体構造を有しています）。CCHサブユニットの複雑な分子配列には、T/Bリンパ球に媒介される強力な免疫反応を誘発する、多様な抗原反復構造が含まれています。

KLH/CCHヘモシアニンは、そのサイズの大きさと分子複雑性の観点から、ハプテンやペプチドに対する抗体産生する免疫原として用いるキャリアタンパク質に推奨されます。さらに、動物やヒト中のヘモシアニンに誘発される強烈なDTH免疫応答は、特定種の癌治療に有益な効果のあることが研究によって示唆されています。癌免疫療法の新たな開発では、新興疾患治療用の新規結合体ワクチン開発におけるヘモシアニン特有の免疫原性が利用されてきました。

ウシ血清アルブミン（BSA;67 kDa）は、アルブミンと呼ばれる血清タンパク質のクラスに属します。アルブミンは、血漿中のタンパク質含有量の約半分を構成し、安定性および可用性が非常に高いです。BSAは、KLHよりはるかに小サイズでありながら、十分な免疫原性があります。これは、弱性の抗原性化合物において一般的なキャリアタンパク質です。BSAは、59個のリジン残基を有する単一ポリペプチドとして存在します。これらの残基のうち30〜35個は、結合試薬と反応可能な第一級アミンを有しています。多数のカルボキシレート基により、BSAへ正味負電荷（PI5.1）が与えられます。Thermo Scientific Imject BSAは、高精製済み（フラクションV）ウシ血清アルブミンであり、再構成された後に、透析や追加精製を行わずにハプテンへの結合を行うために使用できます。

BSAは、イムノアッセイ開発に一般的に使用されています。その理由には、BSAは入手しやすく、完全に可溶性であり、小分子への架橋（架橋以外の方法では、ポリスチレンマイクロプレートへ有効にコーティングされない小分子）に有用な多数の官能基を有している点などが挙げられます。さらに、BSAは、タンパク質アッセイの標準製剤として非常に人気が高く、SDS-PAGEにおいて分子量マーカーとしてよく特徴付けられ、ブロッキング剤として広く利用されています。こうした同じ特性によって免疫測定法の開発においてBSAが扱いやすくなるだけでなく、さらにキャリア-ハプテン複合体の調整および結合効率テストも円滑に行えるようになります。しかし、このようにBSAを多重に使用するには、抗体スクリーニング手順と最終アプリケーションにおいて、キャリアとの望ましくない交差反応を避ける手順をとる必要もあります。

このため、一般的にハプテンに対する免疫応答を生成するキャリアタンパク質としてKLHを用いた後に、抗体のスクリーニングやイムノアッセイで非関連タンパク質キャリアとしてBSAが使用されます。キャリア特異的抗体ではなくハプテン特異的抗体を確実に検出するには、免疫化工程とスクリーニング（または精製）工程それぞれにおいて別々のキャリアタンパク質を使用しなければなりません。BSAを非関連キャリアタンパク質として使用すると、一般的に標準MWマーカーとブロッキング剤としての特性を最大限に有効活用できます。

カチオン化ウシ血清アルブミン（BSA）を調整するには、ネイティブBSAを過剰エチレンジアミンで修飾し、基本的に全ての負荷電カルボキシル基を正荷電第一級アミンでキャッピングします。その結果、ネイティブBSAよりも免疫原性の著しく向上した、高正荷電のタンパク質(pI > 11)が得られます。また、第一級アミンの数が増加すると、標準的架橋法でさらに多数の抗原分子を結合させることができます。

Muckerheide、Domen、Appleらによる一連の研究記事（1987年、1988年）では、免疫応答の生成および調節におけるキャリアタンパク質のカチオン化効果に関する研究が報告されています。（詳細については、リンク先の製品ページをご覧ください。）彼らの研究では、cBSAをキャリアタンパク質として使用した結果、ネイティブ形態のBSAよりはるかに高い抗体応答を刺激する免疫原が得られました。In vivoでは、抗体応答が増強され、応答の上昇状態を長時間維持しました。In vitroでは、T細胞増殖と同程度を産出するには、ネイティブBSAよりもはるかに少ないcBSAしか必要としませんでした。興味深いことに、cBSAに誘発される免疫応答の増強は、結合されたハプテンやタンパク質類にまで拡張されました。例えば、マウスの免疫化に使用したケースでは、cBSAに結合したオボアルブミンは、オボアルブミン単独あるいはオボアルブミン-BSA結合体よりも大量の抗オボアルブミン抗体を産出させました。

オボアルブミン（OVA; 45kDa）は、キャリアタンパク質として使用することができます。オボアルブミン（別名：卵アルブミン）は、鶏卵の白身中タンパク質の75％を構成しています。OVAは、20個のリジン基を含み、多少免疫原性であるものの、通常は免疫化ではなく二次（スクリーニング）キャリアとして使用されます。また、タンパク質は、カルボキシル基を産出する、14アスパラギン酸残基および33グルタミン酸残基を含んでいます。これらの基は、ハプテンとの結合標的として使用できます。オボアルブミンは、多数の疎水性残基および等電点（4.63）を有した、単一ポリペプチド鎖として存在します。56℃以上の温度条件下や、電流または激しい振盪を受けた場合、タンパク質は変性します。OVAは、高濃度の有機溶媒DMSO中で溶解する性質の珍しいタイプのタンパク質であり、水性バッファ中で溶解しづらいハプテンへ結合することができます。

ハプテンをキャリアタンパク質へ結合させるには、いくつかの手法をとることができます。ハプテン上で利用可能な官能基、キャリアに対するハプテンの所要配向および距離、生物学的・抗原性の特性上結合による想定効果に応じて、活用する結合化学を選択します。例えば、タンパク質およびペプチドは、第一級アミン（N末端およびリジン残基側鎖）、カルボキシル基（C末端、またはアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖）、結合標的にできるスルフヒドリル（システイン残基側鎖）などを有しています。通常これは、架橋試薬を介したハプテンへの結合に用いられるキャリアタンパク質中に存在する、多数の第一級アミンです。

大半のタンパク質には、露出したリジン基およびカルボキシル基どちらも含まれているため、タンパク質-キャリア結合やペプチド-キャリア結合を行うには、一般的にカルボジイミド架橋剤EDCを用いて免疫原を形成させる手法が最もシンプルかつ効果的です。EDCは、タンパク質キャリア上もしくはペプチドハプテン上の有効なカルボキシル基と反応して、活性O-アシルイソウレア中間体を形成します。そして、この中間体は第一級アミンと反応して、アミド結合および可溶性の尿素副産物を形成します。この有効反応により、2時間以内に結合免疫原が生成されます。

ポリペプチド抗原やタンパク質キャリアが関与している場合、一般的にEDC媒介性結合により一定量の重合が発生します。大半のペプチドや抗原は、第一級アミン（少なくともN末端において）およびカルボキシレート（少なくともC末端において）のいずれも含んでいるため、この重合が起こります。ペプチドは、キャリアタンパク質だけでなく、ペプチド自身へも結合する（N末端からC末端の「末端から末端」への結合、あるいは側鎖を介した結合）場合があります。同様に、キャリアタンパク質は、キャリアタンパク質自身へ結合します。

このような重合は、免疫原性や所望の抗原特異的抗体の産生において、必ずしもデメリットではありません。大型のポリマーは、結合体の溶解性を低減させることがあるため、後続工程における処理や使用が困難になります。キャリア表面上の一部の重合ペプチドは、ペプチドの免疫原性を実質的に高めることがあり、抗体応答を向上させる効果があります。ペプチドは様々な配向で結合するため、確実に分子の全部分が提示され、全集団内で抗原として使用できるようになります。

末端システイン残基と合成されたペプチドは、特定架橋剤との反応で高特異的な結合部位を供給する、スルフヒドリル基を有しています。例えば、ヘテロ二官能性架橋剤スルホSMCCには、遊離スルフヒドリルと反応するマレイミド基、さらに第一級アミンと反応するスクシンイミジル（NHS）エステルが含まれています。最初にキャリアタンパク質（多数のアミンを有する）へ試薬を反応させた後、還元末端システインを含むペプチドへ反応させることにより、全てのペプチド分子は想定通りの一律の配向で結合させることができます。

これには、2段階の反応戦略をとります。キャリアタンパク質は、モル過剰量のスルホSMCCとの反応により単独で「活性化」されます。NHSエステル基がキャリアタンパク質の豊富なアミノ基に置換される場合、多数のSMCC分子がキャリアタンパク質へ付着します。そして、修飾されたキャリアタンパク質は、ゲルろ過（脱塩）により精製され、過剰量の架橋剤や副生成物が除去されます。この段階では、精製キャリアは架橋剤により産出された修飾状態を有しているため、表面から突出した多数の反応性マレイミド基が生じます。最後に、システイン末端ペプチドまたはスルフヒドリルハプテンなどをマレイミド活性化キャリアタンパク質へ添加します。マレイミド基は、ペプチドのスルフヒドリル（-SH）基と反応して、安定したチオエーテル結合を形成します。

全てのタンパク質は、このようにしてマレイミド活性化させられるため、還元チオールを介してハプテンを有効に結合させることができます。しかし、KLH、BSA、その他の一般的キャリアタンパク質は活性化済みの形態で入手が可能です。また、スルフヒドリルペプチドとの直接的結合に使用できる便利なキットも販売されています。品質テスト済みの高安定性なマレイミド活性化キャリアタンパク質をご購入されると、一貫性の高いパフォーマンスが実現すると同時に処理工程数を減らすことができます。

グルタルアルデヒドを使用して、各ポリペプチド上のアミンを介してペプチドやキャリアタンパク質を架橋させることができます。この手法では、リジン残基またはペプチドのN末端、およびキャリアタンパク質の表面リジンをランダムに標的します。ペプチドのアミノ酸組成（複数の第一級アミンを有しているか否か）にもよりますが、抗原提示（配向）や高負荷（重合）が変動するケースはEDC結合時ほど多くありません。しかし、殊に特異的かつ予測可能でない限り、グルタルアルデヒドは有効な架橋剤であり、現在も抗体生産施設において一般的に使用されています。

また、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）や水溶性の類縁物質であるBS3などの架橋剤を使用して、アミン-アミン架橋を達成することも可能です。長いスペーサーアームが必要な場合、ペグ化版のBS3もご利用いただけます。

免疫原に対する免疫応答を増強させるには、アジュバントと呼ばれる種々の添加剤が使用できます。アジュバントは、混合して免疫原を注射されると、免疫応答を増強させます。アジュバントは、免疫原に対する免疫応答を増強させるものの、アジュバント自体がハプテンへ免疫原性を与えられるわけではないため、キャリアタンパク質の代用物質にはなりません。アジュバントは、免疫応答の非特異的刺激剤であり、注入物質の沈殿や隔離を促進し、抗体応答を飛躍的に増強させます。

完全フロイントアジュバント（CFAまたはFCA）をはじめとして、数多くの好評なアジュバントがあります。本試薬は、油中水型エマルジョンおよび死滅マイコバクテリウムから成ります。油中水型エマルジョンは抗原を長期間局在化させ、マイコバクテリウムは注射部位へマクロファージや適切な細胞類を誘引します。完全フロイントアジュバントは、初回注射（免疫化）時に使用します。後続の追加免疫時には、マイコバクテリウム非含有のエマルジョン；不完全フロイントアジュバント（CFAまたはFIA）中の免疫原を使用します。フロイントアジュバントは非常に有効性が高い反面、毒性マイコバクテリア成分が含まれるため、対象動物および研究者の双方がリスクにさらされます。

フロイントアジュバントの代わりに、水酸化アルミニウム（ミョウバン）溶液が使用できます。ミョウバンは、面倒な乳化を行う必要がないため、フロイントアジュバントよりも容易に免疫原との混合が行えます。これは、完全フロイントアジュバント（CFAまたはFCA）ほど強烈な刺激剤ではないため、完全な非免疫原性化合物に対してほとんど免疫応答を誘発させません。しかし、ペプチド-キャリアタンパク質複合体の大半は、免疫原性であり、ミョウバンから強烈な刺激がもたらされます。ミョウバンは、注射部位における組織壊死をほとんど起こさないため、フロイントアジュバントよりも安全に使用することができます。

アジュバントと混合前の免疫原濃度に応じて、注射1回あたりの複合体の投与量が最終決定されます。以下に記載するプロトコルは、注射および出血において優れた結果を得られることが判明しています。研究者のご都合に応じて、あるいは実験動物の条件がこうした検討事項を満たす時期に合わせて、スケジュールをカスタマイズできます。いずれにしても、激しい反応が動物中で局所的または全身的に観察された場合には、注射を中止してください。これらの実験動物手順を実行するのは、有資格者および認定担当者の方に限ります。これらの技法に精通していない方は、動物の免疫と出血を試みる前に、熟練した研究者からトレーニング指導を受けてください。

マウスの免疫化スケジュール：

• 初日目：免疫化後のELISAスクリーニングの実行時、盲検用としてマウスから免疫前血清を採取します。凍結保存します。マウス1個体あたり50～100μgの免疫原（100～200μLの抗原-アジュバント混合物に相当）を注入します。一般に腹腔内（腹腔内）または皮下（皮下）の経路から注射を行います。動物1個体あたりに、こうした注射を1～2回行えます。
• 14日目：アジュバント中の免疫原の当量を追加免疫します。
• 21日目：出血をテストして、ELISA法で抗体応答をアッセイします。（通常マウスは尾静脈または眼窩後神経叢を介して麻酔下で採血されます）。
• 28日目：必要に応じて再び追加免疫をします。同様のスケジュールを続行して、十分な応答が観察されるまで、追加免疫と試験採血を交互に行います。モノクローナル抗体産生を行うには、腹腔内または静脈内（静脈内）いずれかへ注射をします。生理食塩水（アジュバント非含有）中に溶解した免疫原と融合させる4〜5日前。

ウサギの免疫化スケジュール：

• 初日目：免疫化後のELISAスクリーニングの実行時、盲検用としてウサギから免疫前血清を採取します。凍結保存します。ウサギ背面の皮下部位各8〜10個へ100μgの免疫原（約200μLの抗原-アジュバント混合物に相当）を注入します。別の注入経路がとられる場合もありますが、ウサギを用いるケースでは、この経路が圧倒的に注入しやすいです。
• 14日目：アジュバントの当量を追加免疫します。
• 21日目：出血をテストし、ELISA法で抗体応答をアッセイします。（通常ウサギは耳静脈を介して麻酔無しで採血されます）。抗体応答の測定に必要な十分量の5〜10 mLが容易に採血できます。
• 28日目：必要に応じて再び追加免疫をします。同様のスケジュールを続行して、十分な応答が観察されるまで、追加免疫と試験採血を交互に行います。

抗体のスクリーニング、力価およびアイソタイピングは、あらゆるカスタム抗体生産プロジェクトにおいて、重要なインプロセス型および最終決定型の抗体テスト手順です。これらのテストによって、選定および続行させる免疫動物や細胞株のタイプ、特定アプリケーション用の希釈液や二次試薬、有効な抗体精製法などの決定に必要な情報データが得られます。

血清や腹水の全IgG成分の標準精製を達成するには、プロテインA、プロテインG、または類似の親和性樹脂を使用します。様々なアプリケーションにおいて、たとえハプテン特異的抗体が全体の2〜5％しか占めていない場合でも、標準的なIgG精製を行うことが推奨されます。免疫グロブリン成分類が非特異的結合やバックグラウンドを発生させない限り、これらの成分の存在は問題点となりません。

ハプテン特異的抗体の精製が必要になるアッセイ系や特定実験もあります。これを達成するには、免疫原調製に用いるものと同じキャリアタンパク質を含有しない形態の固体支持体へ、最初のハプテンを固定化させます。こうした精製用の活性化親和性樹脂が多数販売されています。

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