抗体精製法

抗体を精製するには、血清（ポリクローナル抗体）、腹水、ハイブリドーマ細胞株の細胞培養上清（モノクローナル抗体）などに由来する抗体を、選択的濃縮または特異的単離します。精製法のタイプは、未精製から高特異的精製までのレベルがあり、以下のように分類されます：

• 物理化学的分画 – 差動沈殿、サイズ排除、あるいはサイズ・電荷・標準サンプル中の各抗体の共通化学特性などに基づく免疫グロブリンの固相結合。これは、免疫グロブリンを含むサンプルタンパク質のサブセットを単離します。
• クラス特異的な親和性 – 免疫グロブリンに特異的親和性を有する、固定化生物学的リガンド（タンパク質、レクチンなど）による、特定抗体クラスの固相結合（例：IgG）。これにより、抗原特異性に関わらず標的クラスの全抗体が精製されます。
• 抗原特異的な親和性 – 特異的な抗原結合ドメインを介して特定抗原分子へ結合するサンプル中の、抗原特異的抗体のみを親和性精製します。これにより、抗体クラスやアイソタイプに関係なく、抗原へ結合する全ての抗体が精製されます。

標的抗体は（通常の実際目的において）産出サンプル中の免疫グロブリンのみであるため、モノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株として開発され、腹水または細胞培養上清として産生された抗体は、抗原特異的な親和性法（第三タイプ）を用いずに完全に精製することができます。対照的に、ポリクローナル抗体（血清サンプル）には、非特異的な免疫グロブリンの同時精製を避けるため、抗原特異的な親和性精製を行う必要があります。例えば、一般にマウス血清中の総IgGのうちわずか2～5%が、動物免疫化用の抗原に対して特異的です。有効な抗体が得るための精製方式と精製度合は、抗体に意図するアプリケーションに応じて異なります。

血清免疫グロブリンの主要クラス(例：IgG、IgM)は、全体的なアミノ酸組成や溶解特性などの一般構造が共有しています。これらの一般特性は、アルブミンやトランスフェリンといった、血清中に豊富に存在する大半のタンパク質類と十分に異なっているため、こうした分化の物理化学的特性に基づいた免疫グロブリンの選択的濃縮が可能になります。

透析、脱塩、ダイアフィルトレーションなどを実行することにより、特定バッファへ抗体を交換し、望ましくない低分子量（MW）成分を除去することができます。高分子量カットオフ（MWCO）を備えた、透析膜、サイズ排除樹脂、ダイアフィルトレーション装置を用いて、小さなタンパク質やペプチドから免疫グロブリン（>140 kDa）を分離させることができます。しかし特殊なカラムや機器を除いて、これらの技法単独で、標準的抗体サンプル中に存在するタンパク質や高分子からの抗体を精製することはできません。大半のケースでは、ゲル濾過と透析は硫酸アンモニウム沈殿などの後続の精製工程に利用されています（1）。

血清、腹水または細胞培養上清から抗体を濃縮するには、一般に硫酸アンモニウム沈殿を実行します。このリオトロピック塩の濃度がサンプル中で上昇するにつれて、タンパク質や巨大分子類は溶解しにくくなります（沈殿が完了すれば、再び溶解しやすくなります）;リオトロピック効果は「塩析」と呼ばれています。抗体は、大半のタンパク質や血清成分よりも低濃度の硫酸アンモニウムにおいて沈殿します。

硫酸アンモニウム飽和率40〜50％（飽和率100％は4.32Mに相当）で免疫グロブリンが沈殿する一方、タンパク質類は溶液中に残ります（2）。通常の手法では、室温または4℃下で数時間インキュベートした後、中和抗体サンプルへ飽和硫酸アンモニウム溶液の等量を極めて緩徐に添加します。上清の遠心分離および除去を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などのバッファに抗体ペレットを溶解させます。

選択性、収量、純度および沈殿の再現性は、時間、温度、pH値、塩の添加速度などいくつかの要因に依存しています（3）。硫酸アンモニウム沈殿法は、優れた精製法としていくつかの抗体アプリケーションに適用できますが、大半のケースではカラムクロマトグラフィーまたは他の精製法の前の予備段階として実行されています（例：Melon Gel Monoclonal IgG Purification Kit)。部分精製された抗体サンプルを使用すると、パフォーマンスが向上し、アフィニティーカラムの寿命が延長されます。

また、特殊な抗体精製状況用の抗体沈殿試薬には、オクタン酸、ポリエチレングリコール、エタクリジンなどを使用するタイプの試薬があります（3）。

特殊状況での抗体精製を達成させるために、様々な化学系固相クロマトグラフィー法が適合化・最適化されてきました。

イオン交換クロマトグラフィー（IEC）では、所定バッファ系中の正味荷電（pH値）に基づいて、正荷電または負荷電のタンパク質結合用の樹脂を使用します。特にモノクローナル抗体産生の関わる商業的運用においては、高特異性の標的抗体の結合および放出は、イオン交換クロマトグラフィー条件により確定されることがあります。逆に、この条件では抗体を除くあらゆるサンプル成分へ結合することが判明しています。最適化のなされたイオン交換クロマトグラフィー（IEC）は、費用対効果の高い、穏やかで信頼性の高い抗体精製法となります。

固定化金属キレートクロマトグラフィー（IMAC）は、キレート固定化二価金属イオン（通常はニッケル、Ni2+）を用いて、 三つ以上の連続ヒスチジン残基のクラスターを含む、タンパク質またはペプチドを結合します。末端6xHis融合タグを含有するよう操作された組換えタンパク質を精製するには、この戦略が最もよく使用されています。興味深いことに、哺乳動物のIgGは、固定化ニッケルの結合できるヒスチジンクラスターを有する血清（またはモノクローナルハイブリドーマ細胞培養上清）中の低存在量タンパク質のひとつです。IECと同様に、結合および溶出のIMAC条件を特定サンプルへ最適化させて、穏やかかつ信頼性の高い抗体精製を行うことができます（3）。例えば、Pierce Conjugate Purification Kitは、この技法を用いて、標識後にAP標識やHRP標識（酵素標識）の抗体を過剰量の非結合酵素から単離させます。

チオフィリック吸着は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）と硫酸アンモニウム沈殿（リオトロピック効果）の両特性を組み合わせた、高選択性タイプのタンパク質-リガンド相互作用です。この相互作用は、チオエーテルに近接してスルホン基へタンパク質を結合させることから、チオフィリックと呼ばれています。厳密なHICとは対照的に、チオフィリック吸着は高濃度のリオトロピック塩（例：塩化ナトリウムと対照的な硫酸カリウムなど）に依存しています。硫酸カリウムで平衡化された標準的抗体サンプルにおいて、抗体に高特異性の結合が発生します。非結合成分の除去後、抗体は穏やかな溶出条件で円滑に回収されます（例：50 mMリン酸ナトリウムバッファ、pH値7～8）。チオフィリック吸着剤（別名：T-ゲル）は、ガローススルホンチオエーテルリガンドを含有するよう修飾された、アガロースビーズ（6％）です。吸着剤は、様々な動物種由来の免疫グロブリンに対して、結合能力が高く広範な特異性を有しています。特にこれは、ニワトリIgY精製に有効となる数少ない親和性法のひとつです。

メロンゲルは、化学ベース分画による抗体精製用の弊社独自の樹脂化学（および最適化バッファ）です。規定の穏やかなバッファ条件下で、メロンゲル樹脂は、血清、腹水または培養上清中に見られる大半の非IgG性タンパク質へ結合すると同時に、フロースルー分画により精製IgGを回収させます。

IgGを迅速に簡便かつ穏やかに精製するために最適化されたメロンゲルキットが、様々なタイプから取り揃えられています。モノクローナル抗体精製用のメロンゲルキットには、二つの精製技法を組み合わせた利点があります。メロンゲルの最終精製を実行する前に、細胞培養上清サンプルの硫酸アンモニウム沈殿処理が推奨されます。トランスフェリンと抗体との同時精製を軽減させるメロンゲル精製前に、前処理試薬で腹水サンプルを処理することが推奨されます。

メロンゲル系は、負の選択を採用し溶出工程を一切必要としないことから、抗体ストック溶液からウシ血清アルブミン（BSA）やゼラチンを除去する手法（安定化タンパク質を抗体標識手順へ干渉させないため）としても有用かつ効果的です。弊社製品Antibody Clean-Up Kitには、このような基本特性が備えられています。

1種類の望ましくない特定血清成分の特異的除去処理を「抗体精製」の形態としてとらえた場合、アルブミン除去についてここで触れるべきです。アルブミンは、ヒト血清タンパク質の約60％を占めています。Cibacron* Blue Dyeは、ヒト血清アルブミンへ選択的結合し、親和性リガンドとして用いて二次元電気泳動分析用のアルブミン非含有の血清サンプルを調製することができます。

抗体は、相対的不変ドメインなどの進化的保存性の全体構造を有しており、抗体には結合および病原体に対する防御の天然機能が含まれるため、特定の病原性細菌の影響により、特異的抗体結合機能を有するタンパク質が進化を遂げてきたことは当然と言えるでしょう。こうした免疫グロブリン結合性タンパク質の数タイプが同定され、特定種の細菌から単離されています。抗体の天然機能がタンパク質研究用の標的特異的プローブとして有用であるように、これらの天然性抗Igタンパク質も抗体精製用の親和性リガンドとして有用です。

プロテインA、プロテインGおよびプロテインLの三つは、抗体結合特性の十分特徴付けされた細菌タンパク質です。これらのタンパク質は、組換えにより産生され、様々な種から重要な抗体タイプを親和性精製する用途に一般に利用されてきました。この組換え型タンパク質の市販製品の大半は、不要な配列が排除されている（プロテインG由来のHSA結合ドメインを含む）ため、天然対応物より小型です。また、プロテインA/ Gと呼ばれる、プロテインAおよびプロテインGを遺伝子操作した組換え型も一般に入手可能です。組換え型Ig結合性タンパク質の全4種類は、 多様な免疫検出や免疫親和性のアプリケーションにおいて研究者たちに一般的に利用されています。

天然IgG結合性タンパク質の供給源および特性。下表の情報は、様々な供給源から収集されています。免疫親和性アプリケーション用の組換え型に関する参考文献と詳細については、関連「詳細情報」ページをご覧ください。

プロテインA、プロテインG、プロテインA/ GまたはプロテインLを用いて抗体精製を達成するには、多孔質樹脂（例：アガロースビーズ）上または磁気ビーズ上にこれらのプロテインを共有結合固定化します。これらのタンパク質は数種類の抗体結合ドメインを含むため、個々の固定化分子の大半は、その配向に関わらず機能的な非障害性の結合ドメインを最低限ひとつ維持します。さらに、タンパク質は抗原結合ドメイン以外の部位で抗体へ結合するため、免疫沈降などの精製スキーム（抗原に結合している抗体へ結合することにより、抗体結合性タンパク質を用いてサンプル由来の抗原を精製する）に、こうした固定化形態タンパク質を使用することができます。

プロテインA、G、A / GおよびLの各結合特性は異なるため、各プロテインの適する抗体標的タイプが異なります（例：抗体のサブクラスまたは動物種）。プロテインA、GまたはLを使用すると粗サンプルから標準的免疫グロブリンが精製されることを認識する必要があります。サンプルの供給源に応じて、サンプル中の全免疫グロブリンのうち、極めてわずかな部分のみを抗原特異的抗体が占める場合があります。例えば、マウス血清中の総IgGのうち動物免疫化用の抗原に特異的なIgGは一般にわずか2～5％です。

プロテインAアガロース樹脂のカラムおよびウサギ血清を例として用いて、以下の基本手順でこれらのリガンドで抗体精製を行います：

1. 結合：純粋な生理的バッファ (pH値 7～8) のウサギ血清サンプルをカラムへ添加し、ゆっくり通過させるか、あるいはプロテインA樹脂と混合させて、IgGを固定化リガンドへ結合させます。
2. 洗浄：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加して、カラム中を通過させ、未結合の血清成分を除去させます。樹脂容量の5〜10倍容量の洗浄バッファをご使用ください。
3. 溶出：酸性溶出バッファを添加（例：0.1Mグリシン-HCl、pH値2.8）して、カラムから溶出する小分画の溶液を収集します。低pH条件下では、 固定化プロテインAから抗体が解離され、一つから複数の回収画分の精製状態でIgGが回収されます。
4. 中和またはバッファ交換： 精製抗体を含有した溶出画分を同定および結合するには、タンパク質アッセイまたはその他の手法をご使用ください。そして、1M トリス-HCl（pH値8.5）の1/10容量を添加して、バッファを中和させます。また、長期保存により適したバッファへ精製抗体を移し変えるには、脱塩カラムまたは透析法をご活用ください。

IgMのFc領域の結合部位が五量体構造によって立体的に妨害されるため、プロテインAおよびプロテインGは、IgMへの結合力が非常に弱く、場合によっては全く結合しません。適切なタイプの軽鎖（VL-κ）を有するIgM（クラスM抗体）に関して、タンパク質Lは精製に使用できます；ただし、同型の軽鎖を有するIgGが同時精製されます。

商業規模での運用において、一般に硫酸アンモニウム沈殿の後、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーまたはゾーン電気泳動などの技法を組み合わせてIgM抗体の精製が行われます。血清サンプル（ポリクローナル）におけるシンプルな濃縮戦略では、硫酸アンモニウム沈殿後にプロテインAまたはGでIgGを除去します。

Netheryら（4）により、細胞表面上の炭水化物を認識するC1q、439 kDa補体成分を用いた、IgMの親和性精製法が開発されました。Nevensら（5）により、マンナン結合タンパク質（MBP）と呼ばれる、 類似構造の補体活性化タンパク質のリガンドとして使用することでこの手法が拡張および改善されました。弊社のIgM精製キットは、固定化MBPを使用し、腹水由来マウスIgMの精製に極めて高い効果があります。精製IgMは、アフィニティーカラムの単一経路から取得できます。ヒトIgMは、結合能力が極端に低いながらも、支持体へ結合し、少なくとも純度88％（HPLCによる評価）の生成物を産出します。他の種やマウス血清由来のIgMの精製は、いまだ最適化がなされていません。

ジャカリンは、ジャックフルーツの種子（パンノキ属のintegrifolia）から抽出された、a-D-ガラクトース結合性のレクチンです。このレクチンは、4つの同一サブユニットから構成される約40kDaの糖タンパク質です。アガロースなどの支持体上に固定化されたジャカリンは、ヒト血清または分泌型IgA1の精製に有効に活用されてきました。親和性リガンドにより、ヒト血清中または初乳中のより高存在量のIgGやIgMから、IgAの精製や除去が可能になります（6）。IgDは、ジャカリン（7）へ結合することが報告されています。

ニワトリIgYは、IgYと呼ばれる独自の免疫グロブリン分子を生成します。IgYを産出および使用した場合、哺乳動物免疫グロブリンよりもいくつかの利点があります。産出に関して、ニワトリの飼育や免疫化は比較的簡単です。ニワトリは、保存された哺乳類タンパク質抗原に対して免疫応答を生成する可能性が高くなり、ウサギの15〜20倍以上の抗体を産出します。

何よりもまず、IgYは天然状態で卵黄中に高濃度で包まれているため、免疫化した非侵襲性の雌鶏から繰り返し抗体を回収することができます。免疫化ニワトリの卵黄1個につき約300 mg の IgYが含有されています。後で抗体を抽出するために、全卵や分離卵の卵黄を採取して冷凍保存しておくことが可能です。

プロテインA、プロテインG、およびFc結合性タンパク質類はIgYへ結合しません。チオフィリック吸着（上記をご参照ください）は、血清や流体からのIgY精製に有効です。しかし、卵黄（脂質濃度が非常に高い）を使用する有効なチオフィリック吸着手順は開発されていません。代わりに、弊社のChicken IgY Purification Kitをご利用ください。本キットは、最初に独自溶液で卵黄サンプルを脱脂した後、様々な硫酸アンモニウム沈殿を活用して卵黄からIgYを有効に精製します。

タンパク質A、G、A / GおよびLは、サンプルから全IgGを精製するリガンドとして優れていますが、通常は抗原特異的抗体の精製が必要になります。免疫化用の特定抗原を固定化することによりこの精製が行えるため、抗原へ特異的結合した抗体のみをこの手順で精製できます。ペプチド固定化用の活性化親和性支持体や、親和性精製用の抗原類については、「Ligand Immobilization Methods for Affinity Purification（親和性精製におけるリガンド固定化法）」（リンクは近日公開予定）というタイトルのページで改めてご紹介いたします。本ページでは、抗体精製における抗原固定化に関連した、特定の問題点について概説いたします。

抗体の親和性精製を達成するには、抗原上の関連エピトープを抗体の結合部位へ有効に提示させる必要があります。抗原が微細で、複数の化学結合により固体支持体表面へ直接固定化されている場合、重要なエピトープがブロックまたは立体障害を受けて、有効な抗体結合が阻害されます。そのため、独自の官能基（例：ペプチド内の単一の末端システイン上のスルフヒドリル）を用いて、ペプチド抗原を固定化させるのが最適です。同様に、数原子長のスペーサーアーム上に発生する反応性基を有した活性化支持体を使用する方法も最良です。特に複数の固定化部位を有するような大きな抗原（例：タンパク質）の場合、抗原自体が支持体マトリックスとエピトープ間の有効スペーサーとして機能するため、スペーサーアーム長はとりわけ重要な要素ではありません。一般的に、抗体産生を促進するために抗原がクロスキャリアタンパク質へ結合されている場合、同じ化学反応を用いた親和性精製で抗原を固定化させると、最良の結果が得られます。このようにして、全てのエピトープは抗体の結合に利用できるため、特異的免疫グロブリンの精製と回収の効率性が飛躍的に向上します。

抗体の大半は、合成され、KLHなどの免疫原性キャリアタンパク質へ結合したペプチド抗原を用いて産出されます。このような抗原をカスタマイズして、結合および固定化の両方について独自の官能基（ハンドル）を含有させることができます。このためには、一般に末端システインが添加されます；こうして、マレイミド活性化キャリアタンパク質への結合効率を上げ、ヨードアセチル活性化アガロース樹脂上への固定化効率を上げる、スルフヒドリル基が得られます。

また、アミン官能化樹脂とEDC架橋剤を用いて、カルボキシル基（C末端）を介してペプチドを固定化させる一般戦略もあります。ペプチドは、アミンおよびカルボキシル末端の両方（また、場合によっては、内部リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基など）を有しているため、EDCに起因するカルボキシル-アミン架橋によりペプチドが重合および固定化されて、親和性結合において様々な配向でペプチドが抗体へ提示されます。CarboxyLink Immobilization Kitには、このような基本特性が備えられています。

特殊状況を除いて、一般にタンパク質抗原の固定化は、親和性精製において第一級アミンを標的する方法が最も簡単です。通常これは、タンパク質構造の外表面の様々な位置で起こります（リジン基またはサブユニットN末端のある各位置）。この種の固定化には、数タイプの高性能なアミン反応性の親和性支持体が使用できます。

また、タンパク質抗原が精製糖タンパク質であり炭水化物基が目的エピトープでない場合には、抗原が過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された後、糖を介して抗原を共有結合的固定化させることも可能です。GlycoLink Immobilization Kitには、このような基本特性が備えられています。

標準的な結合条件と溶出条件は、それぞれの抗原と抗体の天然親和性の相互作用に基づいているため、抗体の抗原特異的な親和性精製に関するこれら両条件間でほとんど変動がありません。つまり、抗体は生理的条件下で抗原を認識し結合するよう設計されているため、大半の親和性精製手順では生理的pHおよびイオン強度を模倣した結合条件を適用しています。主要な結合バッファは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）とpH値7.2のトリス緩衝食塩水（TBS）です。抗体が固定化抗原に結合した後、付加的な結合バッファを用いて支持体から未結合物質を除去します。非特異的結合を最小限に抑える目的で、多くの研究者によって、弱相互作用を破壊する付加塩または界面活性剤を含有した洗浄バッファが使用されています。

抗原結合性の相互作用を破壊するバッファのpH強度やイオン強度を適正に変更することによって、特異的な精製抗体を親和性樹脂から溶出させることができます。大半の抗体は、適度に弾力性のあるタンパク質であり、pH 値2.5〜11.5の範囲で持続的に活性化状態を維持します。また、主要な一般溶出戦略では低pH値に設定します。場合によっては、抗体-抗原相互作用はpH値を変更しても効果的に破壊されず、あるいはpHによる障害を受けないため、代替戦略をとる必要があります。

1. Grodzki, A.C. and Berenstein, E. (2010).Antibody purification: ammonium sulfate fractionation or gel filtration.In: C. Oliver and M.C.Jamur (eds.), Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 588:15-26.Humana Press.
2. Harlow, E. and Lane, D. (1988).Antibodies: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.Gagnon, P. (1996).
3. Gagnon, P.S.(1996).Purification Tools for Monoclonal Antibodies.Validated Biosystems.Tuscon, AZ.
4. Nethery, A., et al.(1990).J. Immunol.Method 126, 57-60.
5. Nevens, J.R., et al.(1992).J. Chromatogr.597, 247-256.
6. Roque-Barreira, M.C. and Campos-Neto, A. (1985).J. Immunol.Method 134(30), 1740-1743.
7. Aucouturier, P., et al.(1987).Mol.Immunol.24(5), 503-511.