ウェスタンブロッティング用やELISA用のブロッキングバッファー

ウェスタンブロッティング用のメンブレン支持体は、タンパク質に対して高親和性を有しています。したがって、ゲルからタンパク質を転写した後、後続工程で検出抗体が非特異的結合するのを防ぐため、メンブレンの未結合表面をブロッキングすることが重要です。膜上の遊離部位をブロッキングするには、ミルクや正常血清から高精製タンパク質まで、多種多様なブロッキングバッファーが使用されてきました。ブロッキングバッファーには、バックグラウンド干渉を低減させてシグナル対ノイズ比を改善することで、アッセイ感度を向上させる効用があります。ブロッキングバッファーは、非特異的相互作用の全潜在部位へ結合し、抗体結合エピトープを変更または不明瞭化することなくバックグラウンドを完全に排除するタイプが理想的と言えます。

所定ブロット用ブロッカーには、抗原自体や使用する検出標識タイプに応じて適切なものを選択します。例えば、アルカリホスファターゼ複合体が用いられるアプリケーションでは、PBSはアルカリホスファターゼへ干渉するため、TBSブロッキングバッファーを選択することが推奨されます。特定イムノアッセイ用のブロッキング工程を適正に最適化するには、必ず実験的テストを行います。非特異的結合には、所定イムノアッセイ試薬類に特有なタンパク質間相互作用などの様々な要因が影響し得ます。ブロッカーを選択する際には、シグナル対ノイズ比を最も重点的に考慮すべきです。シグナル対ノイズ比は、標的分析物の非含有性サンプルから得るシグナルに対して、標的分析物の含有性サンプルから得るシグナルとして測定されます。ブロッカー使用量が不十分であると、バックグラウンド染色が過剰となり、シグナル対ノイズ比を低減させる要因となります。過剰濃度のブロッカーを使用すると、抗体-抗原相互作用がマスクされたり、マーカー酵素が阻害されることから、こちらもシグナル対ノイズ比を低減させる要因となります。新たなイムノアッセイを開発する際、アッセイで生成されるシグナル対ノイズ比を最大限高めるには、必ず数種類のブロッカーをテストします。抗体-抗原の各ペアはそれぞれ固有の特性を有しているため、いかなる条件にも万能型のブロッキング剤というものは存在しません。

下図では、ウェスタンブロッティング最適化実験の一環として、各種ブロッキングバッファーのテスト数値を示しています。この実験例（バッファー条件以外は全て共通条件を適用）では、各種ブロッキングバッファーによって、各タンパク質に対するウェスタンブロッティングの感度と特異性がクエンチまたは強化されました。これ以外の場合、ブロッキングバッファーのタイプによっては、斑点や高バックグラウンドが発生する可能性があります。