化学発光ウェスタンブロッティング

化学発光基質は、検出光が酵素-基質反応の発生時のみ提示される反応過渡的生成物である点において、他の基質とは異なります。これは安定した着色生成物を生成する基質とは対照的です；これらの着色沈殿物は、酵素-基質反応の停止後、膜上に残存します。化学発光ウェスタンブロッティングにおいて、基質は反応の限定試薬です；基質が消耗するにつれ、発光量が下がり最終的には発光が停止します。適切な抗体希釈液を用いて適正な最適化手順を取れば、数時間安定して発光するため、一貫性のある高感度なタンパク質検出が可能になります。

固定化西洋ワサビペルオキシダーゼとの過酸化水素の反応による過酸化物の局所的形成により、こうした好評なウェスタンブロッティングシステムが形作られています。基底状態へ再び減衰するにつれ、3-アミノフタル酸は425 nmで発光します。X線フィルム、CCDカメラ撮像装置、化学発光を検出するホスホイメージャなどで、これらの発光を捕捉できます。X線フィルムは、定性的や半定量的なデータが得られることから、標的タンパク質の存在を確認するのに有用です。しかし一方で冷却CCDカメラは、以下の点でX線フィルムよりも優れています：定性分析、瞬時に画像操作できる、高感度、高解像度、広いダイナミックレンジ。そのうえ、貴重な研究時間を暗室作業に割く必要もありません。

技術革新や機器類の価格低下に伴い、デジタルカメラやイメージャーによる電子データ捕捉が一般的になりつつありますが、化学発光を用いたウェスタンブロッティングの取得データは、現在でも主にX線フィルムで捕捉されています。シグナルとバックグラウンド間のバランスをうまく取るには、数種類のフィルムを用意して、それぞれ異なる時間をかけて露出させます。これによって、低バックグラウンドに維持しながら目的シグナルを明瞭に可視化できるように、フィルムへの膜の暴露時間を計測します。プロセス観察や目的エンドポイント到達時点でプロセスを停止できないため、これは達成が困難です。十分な時間をかけてフィルムを露出させない（露出不足）と、シグナルが可視化されません。反対にフィルム露出時間が長過ぎる（露出オーバー）と、シグナルがバックグラウンド中に失われたり、各バンドが混ざり合って不鮮明になることがあります。

露出オーバーさせてしまったフィルムを露出後最適化するには、フィルム処理オプションをご利用ください。データ整合性を維持したまま、効果的にフィルム露光時間を短縮させることができます。研究室の卓上で気軽に実行できます。シグナルが明瞭に可視化されバックグラウンドが最小限となった時点でプロセスを停止できます。

ウェスタンブロット検出では、タンパク質サンプルと共に膜へ転写される着色分子量マーカーの使用が推奨されます。膜上に分子量マーカーが現れると、検出される全てのタンパク質バンドに関する分子量が推定できます。また転写工程前に、ゲル中の目的タンパク質を効果的に分離することも可能になります。ウェスタンブロッティングで化学発光検出を行う場合、X線フィルムまたはデジタル画像装置でタンパク質バンドを検出します。分子量マーカー（未改変型）は、発光を生成しないため、フィルム上や画像システムには表示されません。この場合、下記のような各解決法を取ります。

ひとつには、プロテインAまたはG由来の抗体結合ドメインを用いた分子量マーカーを利用する解決法があります。このタンパク質の抗体捕捉ドメインは分子量マーカーへと操作されているため、ウェスタンブロットに用いられる抗体へ結合します。この結果、実験データと共にシグナルを生成・捕捉することができます。プロテインAおよびGに対する抗体の親和性は変動するため、これらのマーカーのアプリケーションは限られています。マウスIgG1サブクラス抗体をはじめとした多くの抗体は、プロテインAまたはGへ強力には結合しません。

また、ビオチン化タンパク質分子量マーカーを利用する解決法もあります。検出抗体を併用した場合や、ビオチン化一次検出抗体を用いた場合にストレプトアビジンを使用できます。