タンパク質アッセイの化学

BCA法やローリー法といった銅ベースタンパク質アッセイは、名高い「ビウレット反応」に依存しています。この反応において、酒石酸カリウムナトリウムを含むアルカリ性環境下で、三つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドと第二銅イオン（Cu2+）は、共に着色キレート錯体を形成します。これは、有機化合物ビウレット（NH2-CO-NH-CO-NH2）と第二銅イオンで形成される複合物に化学的に類似することから、ビウレット反応として知られるようになりました。過剰尿素や熱による生成物のビウレットは、銅と反応して、ライトブルーの四座錯体を形成します。

単一アミノ酸やジペプチドはビウレット反応を発生させませんが、トリペプチドや大型ポリペプチドもしくはタンパク質は反応を起こし、紫色からライトブルーの540 nm吸光性の複合体を生成します。一つの第二銅イオンにつき4〜6個の着色配位錯体が、ペプチド結合付近で形成されます。発色強度は、反応に関与するペプチド結合数に比例します。したがってビウレット反応は、総タンパク質濃度の定量測定の同一名称の簡便かつ迅速に処理が行える比色試薬の基となっています。ビウレットアッセイの作用範囲は5～160 mg/mlであり、いくつかの産業用アプリケーションで十分に利用できますが、あらゆるタンパク質研究ニーズに適う感度レベルには全く達しません。

BCAタンパク質アッセイは、1985年にSmithらにより導入されました。 それ以来、このアッセイ法は総タンパク質の比色検出や定量の主要メソッドとなっています。BCAアッセイのひとつの注目すべき利点として、当時用いられていた他のメソッド（例：ブラッドフォードアッセイやローリーアッセイ）と異なり、最大5%の界面活性物質（洗浄剤）を含有するサンプルに対応します。また異なるタンパク質に対して、BCAアッセイはブラッドフォード法よりも均一性高い反応を示します。

BCAタンパク質アッセイは、ビシンコニン酸（BCA）により得られた第一銅カチオン（Cu1+）の高感度かつ選択的な比色検出と、タンパク質誘導性ビウレット反応（上記をご参照ください）を組み合わせます。つまり、2つの工程が関与します。最初の工程はビウレット反応です。第一銅イオンへ第二銅イオンを還元すると、かすかな青色が発生します。次の工程では、第一銅イオンでBCAをキレート化させると、強烈な紫色を発します。BCAの2分子を単一の第一銅イオンでキレート化させると、紫色の反応生成物が形成されます。BCA/銅錯体は水溶性であり、タンパク質濃度を上昇させながら562 nmで強い線形吸光度を示します。550 nm～570 nm間のあらゆる波長において、紫色は最小限のシグナル損失率（10%未満）で測定が可能です。BCA試薬は、ビウレット試薬よりも約100倍高感度（検出下限値）です。

Cu2+還元の結果としてBCA色形成を発生させる反応は、タンパク質中の3つの特定アミノ酸残基（システイン/シスチン、チロシンおよびトリプトファン）の存在から特に影響を受けます。明らかにこれらのアミノ酸により、ビウレット反応において銅の還元が強化されます。これにより着色BCA-Cu1+キレートが形成されます。しかしジペプチドとトリペプチドを用いて行った研究によると、各4種類のBCA反応性アミノ酸によって発色され得る以上に、ジペプチドとトリペプチドから発色することが明らかとなっています。言い換えれば、ペプチド骨格（つまり総タンパク質量）は、ビウレット反応における銅の還元やBCAアッセイにおける発色作用の主要要因となります。BCAタンパク質アッセイにおけるタンパク質間のわずかな差異は、各タンパク質間におけるこれら3つのアミノ酸に関する組成物の違いに起因しています。

BCAが第一銅イオンへ結合することにより、ビウレット反応で弱キレート化されたペプチドが効果的に除去されます。すると、これらのペプチド基は第二銅イオンの別分子へ結合できる状態となります。そのため、ビシンコニン酸銅が大過剰に存在する場合（BCAタンパク質アッセイ試薬においては一般的）、タンパク質アッセイはエンドポイントを達成できません。また、インキュベーション温度によって、BCAの色形成速度が異なります。従って、BCAアッセイ法で正確な結果を得るには、標準物質と未知サンプルを同じインキュベーション時間や温度条件におけるように、両物質を同時アッセイすることが重要です。こうした方法でアッセイが実行されるのであれば、アッセイ特性を利用して素早く発色させたり、あるいは必要に応じて目的の発色状態へ発展するまで長めに処理することも可能です。

また、BCAアッセイで銅を還元する物質は発色するため、タンパク質定量の精度に干渉します。銅をキレート化する試薬の干渉により、タンパク質で生成されるBCA発色レベルも減衰します。特定の単一アミノ酸（システインまたはシスチン、チロシン、およびトリプトファン）は、発色すると共にBCAアッセイへ干渉もします。テクニカルヒントやBCAタンパク質アッセイ特殊製品を活用して、こうしたサンプルの非適合性問題に何らかの手段で対処できます。

タンパク質アッセイのローリー法は、開発導入者であるOliver H. Lowry氏(Lowryら、1951年)にちなんで命名されています。この手法により当時のタンパク質アッセイが飛躍的に改善され、彼の論文は生命科学文献の中でも、長年にわたり最も引用回数の多い参考文献の一つとなっています。ローリー法タンパク質アッセイ修正版では、ローリー氏自身の記述した2つの不安定試薬に代わる安定試薬が使用されています。原則的に本アッセイは、銅キレート化化学を伴う強化されたビウレットアッセイです。

ローリーアッセイは、BCAタンパク質アッセイに発色メカニズムが類似していますが、両メカニズムには大きな違いがいくつかあります。ローリーアッセイにおける正確な発色メカニズムについては、まだほとんど判明していません。本アッセイでは、二つの工程を実行します。最初の工程では、酒石酸塩の存在下でアルカリ性硫酸銅とタンパク質を室温下で10分間反応させます。During this incubation, a tetradentate copper complex forms from four peptide bonds and one atom of copper (this is the "biuret reaction").Second, a phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution is added.This compound (called Folin-phenol reagent) becomes reduced, producing an intense blue color.It is believed that the color enhancement occurs when the tetradentate copper complex transfers electrons to the phosphomolybdic-phosphotungstic acid complex.The blue color continues to intensify during a 30 minute room temperature incubation.It has been suggested that during the 30 minute incubation, a rearrangement of the initial unstable blue complex leads to the stable final blue colored complex which has higher absorbance (Lowry, et al.1951; Legler, et al.1985).

The final blue color is optimally measured at 750nm, but it can be measured at any wavelength between 650nm and 750nm with little loss of color intensity.It is best to measure the color at 750nm since few other substances absorb light at that wavelength.

For small peptides, the amount of color increases with the size of the peptide.The presence of any of five amino acid residues (tyrosine, tryptophan, cysteine, histidine and asparagine) in the peptide or protein backbone further enhances the amount of color produced because they contribute additional reducing equivalents to further reduce the phosphomolybdic/phosphotungstic acid complex.With the exception of tyrosine and tryptophan, free amino acids will not produce a colored product with the Lowry reagent, however, most dipeptides can be detected.In the absence of any of the five amino acids listed above in the peptide backbone, proteins containing proline residues have a lower color response with the Lowry reagent due to the amino acid interfering with complex formation.

Unlike in the BCA assay, the secondary binding step in the Lowry method does not involve detachment of the peptide-copper chelate.Therefore, the Lowry method is effectively an end-point assay.Although it is always best to include internal standards in any protein assay, it is possible to obtain reasonable protein estimations with this assay method by comparing to a previously-plotted standard curve.

The protocol requires that the Folin phenol reagent be added to each tube precisely at the end of the ten minute incubation.At the alkaline pH of the Lowry reagent, the Folin phenol reagent is almost immediately inactivated.Therefore, it is best to add the Folin phenol reagent at the precise time while simultaneously mixing each tube.Because this is somewhat cumbersome, some practice is required to obtain consistent results.This also limits the total number of samples that can be assayed in a single run.If a ten second interval between tubes is used, the maximum number of tubes that can be assayed within ten minutes is sixty (10 seconds/tube x 60 tubes = 600 seconds or 10 minutes).

The Lowry assay reagent forms precipitates in the presence of detergents or potassium ions.When potassium ions are the cause, the problem can sometimes be overcome by centrifuging the tube and measuring the color in the supernatant.Most surfactants cause precipitation of the reagent even at very low concentrations.One exception is sodium dodecyl sulfate (SDS), which is compatible with the reagent at concentrations up to 1% in the sample.Chelating agents interfere by binding copper and preventing formation of the copper peptide bond complex.Reducing agents and free thiols also interfere by reducing the phosphotungstate-phosphomolybdate complex, immediately forming an intensely blue colored product upon their addition.

The Modified Lowry Protein Assay Reagent must be refrigerated for long-term storage, but it must be warmed to room temperature before use.Using cold Modified Lowry Protein Assay Reagent will result in low absorbance values.

Use of Coomassie G-250 dye in a colorimetric reagent for the detection and quantitation of total protein was first described by Dr. Marion Bradford in 1976 (Bradford, 1976).Thermo Scientific Pierce Coomassie and Coomassie Plus Protein Assay Products are variants of the reagent first reported by Bradford.

In the acidic environment of the reagent, protein binds to the Coomassie dye.This results in a spectral shift from the reddish/brown form of the dye (absorbance maximum at 465nm) to the blue form of the dye (absorbance maximum at 610nm).The difference between the two forms of the dye is greatest at 595nm, so that is the optimal wavelength to measure the blue color from the Coomassie dye-protein complex.If desired, the blue color can be measured at any wavelength between 575nm and 615nm.At the two extremes (575nm and 615nm) there is a loss of about 10% in the measured amount of color (absorbance) compared to that obtained at 595nm.

Development of color in Bradford protein assays is associated with the presence of certain basic amino acids (primarily arginine, lysine and histidine) in the protein.Van der Waals forces and hydrophobic interactions also participate in the binding of the dye by protein.The number of Coomassie dye ligands bound to each protein molecule is approximately proportional to the number of positive charges found on the protein.Free amino acids, peptides and low molecular weight proteins do not produce color with Coomassie dye reagents.In general, the mass of a peptide or protein must be at least 3000 daltons to be detectable with this reagent.In some applications this can be an advantage.For example, the Coomassie Protein Assay has been used to measure "high molecular weight proteins" during fermentation in the beer brewing industry.

Coomassie dye binding assays are the fastest and easiest to perform of all protein assays.The assay is performed at room temperature and no special equipment is required.Standard and unknown samples are added to tubes containing preformulated Coomassie assay reagent and the resultant blue color is measured at 595nm following a short room temperature incubation.The Coomassie dye-containing protein assays are compatible with most salts, solvents, buffers, thiols, reducing substances and metal chelating agents encountered in protein samples.

The main disadvantage of Coomassie based protein assays is their incompatibility with surfactants at concentrations routinely used to solubilize membrane proteins.In general, the presence of a surfactant in the sample, even at low concentrations, causes precipitation of the reagent.In addition, the Coomassie dye reagent is highly acidic, so proteins with poor acid-solubility cannot be assayed with this reagent.Finally, Coomassie reagents result in about twice as much protein-to-protein variation as copper chelation-based assay reagents.

The ready-to-use liquid Coomassie dye reagents should be mixed gently by inversion just before use.The dye in these liquid reagents forms loose aggregates within 60 minutes in undisturbed solutions.Gentle mixing of the reagent by inversion of the bottle will uniformly disperse the dye and ensure that aliquots are homogeneous.After binding to protein, the dye also forms protein-dye aggregates.Fortunately, these protein-dye aggregates can be dispersed easily by mixing the reaction tube.This is common to all liquid Coomassie dye reagents.Because these aggregates form relatively quickly, it is also best to routinely mix (vortex for 2-3 seconds) each tube or plate just before measuring the color.

Introduced in 2008, the Thermo Scientific Pierce 660nm Protein Assay is a dye-based reagent that offers the same convenience as Coomassie-based assays while overcoming several of their disadvantages.In particular, the Pierce 660nm Assay is compatible with most detergents and produces a more linear response curve.

The detailed assay chemistry is proprietary, but the essential mechanism can be summarized as follows.The reagent contains a proprietary dye-metal complex in an acidic buffer.The dye-metal complex binds to protein in the acidic condition, causing a shift in the dye's absorption maximum, which is measured at 660nm.The reagent is reddish-brown and changes to green upon protein binding.

The color produced in the assay is stable and increases in proportion to a broad range of increasing protein concentrations.The color change is produced by the deprotonation of the dye at low pH facilitated by protein-binding interactions through positively charged amino acid groups and the negatively charged deprotonnated dye-metal complex.

The assay binds to proteins in a manner similar to Coomassie dye.Thus, it has similar protein-to-protein variability to Coomassie (Bradford) assay methods.However, unlike Coomassie-based assays, the Pierce 660nm Protein Assay is fully compatible with nonionic detergents typically used in protein samples.In fact, when used with the Ionic Detergent Compatibility Reagent (IDCR), the Pierce 660nm Assay is also compatible with sample containing Laemmli SDS sample buffer with bromophenol blue and other buffers containing common ionic detergents.

1. Bradford, M.M.(1976).Anal.Biochem.72 , 248-254.
2. Smith, P.K., et al.(1985).Anal Biochem.150 , 76-85.
3. Krohn, R.I.(2002).The Colorimetric Detection and Quantitation of Total Protein, Current Protocols in Cell Biology , A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
4. Krohn, R.I.(2001).The Colorimetric Determination of Total Protein, Current Protocols in Food Analytical Chemistry , B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
5. Lowry, O.H., et al.(1951).J Biol Chem.193 , 265-275.
6. Legler, G., et al.(1985).Anal.Biochem.150 , 278-287.