プローブとしての二次抗体

二次抗体では、標的に特異的に結合した一次抗体を介して、間接的に標的を検出する事ができます。二次抗体は、使用する一次抗体のホストの生物種、およびアイソタイプに対して特異性のあることが求められます。また一般に二次抗体は検出可能なタグや、精製や検出を容易にするための標識がされています。

間接検出法では、一次抗体による直接検出法と比較すると、操作ステップが多くなりますが、検出感度が高くなるという利点があります。間接検出法では、1つの一次抗体に対して複数の二次抗体が結合されるため、シグナルが増強されます。また二次抗体は、アイソタイプ/ホスト生物種の組合せが同一であれば、さまざまな一次抗体に併用することが可能です。標識された一次抗体を用いる場合より汎用性はかなり高くなります。一般的なホスト生物種由来の一次抗体であれば、さまざまな標識が施された二次抗体が市販されており、さらに検出用試薬も製品化されています。

二次抗体は、次の3タイプの形態で提供されます： whole IgG；F(ab')2フラグメント（二価抗体）； Fabフラグメント（一価抗体）。

通常、二次抗体は、免疫動物（ホスト）の血清からアフィニティー精製されます。最初の精製では、、免疫抗体に結合する全免疫グロブリンが回収されます。主に約150 kDa のIgGクラスから構成されています。さらに、プロテインAまたはGを用いて、さらに精製することにより、IgG以外の免疫グロブリンクラスを完全に除去します。上記の方法で生産されたWhole IgG二次抗体は、ほぼすべてのアプリケーションに利用可能で、非常に安価です。

Whole IgGは、ほとんどのアッセイに利用できます。一方で、特定の方法では、Fc領域を除いた抗体が適する場合もあります。抗体の分子サイズが小さい方が有効であったり、抗体のFc部分に結合するタンパク質( Fcレセプター、プロテインA、プロテインGなど)を避けたい場合に使用されます。いくつかの生物種由来のIgGは、ペプシン消化によってFc領域を除去することができ、残った2価のF(ab')2フラグメント抗体（約100kDa）が得られます。

ペプシン処理後、プロテインAまたはプロテインBカラムを用いることにより、F(ab')2フラグメントを精製する事が可能です。この処理により、未消化のIgGや、Protein A/G結合ドメインを有するFcフラグメントを除去します。小さく分断されたFcフラグメントは、透析やゲル濾過、あるいはアフィニティ精製によって、ある程度の除去が可能です。

マウスIgG1(モノクローナル抗体の主要アイソタイプ)は、ペプシン切断に耐性があるため、フィシンによる消化を行います。ただし、プロテインAは、マウスIgG1へのアフィニティが低いのでご注意ください。プロテインAをマウスIgG1に使用する場合には、特化した結合条件の使用が推奨されます。また、マウスIgG1にアフィニティーの高いタンパク質Gによる精製も有効です。

Fabフラグメント抗体は、パパイン処理によって産生されます。一部の生物種由来のIgGは、パパインによる酵素消化によって、抗原の結合ドメインとヒンジ領域が切断され、2つのFabフラグメントとFcフラグメントに分かれます。一価のFabフラグメント抗体は、ブロッキングの用途に有用です。また、結合比のコントロールやFc相互作用の排除などが要求される特殊なケースに利用される場合もあります。低分子の(~50 kDa) Fabフラグメントを用いると、Whole IgGよりも、組織切片サンプルの内部へ浸透するため、抗原検出が向上します。

固定化パパインを用いると、Fabフラグメントから簡単に酵素を除くことができます。パパイン消化では、IgGは高度に断片化されないため、反応後プロテインAまたはプロテインGのカラムで、インタクトなFcフラグメントや未消化のIgGを除去することが可能です。必要に応じて、プロテインAまたはプロテインGのカラムを介した消化反応によってインタクトなFc断片や未消化IgGを除去することも可能です。

マウスIgG1抗体のFc部分を除去するには、フィシンによる消化が適しています。

二次抗体は、一次抗体を産生した動物種の免疫グロブリンに対する抗体で、一次抗体のホストとは異なる動物種で産生したものを使用します。例えば抗マウス抗体は、マウス以外の動物にマウス抗体をインジェクションすることによって産生されます。二次抗体の産生では、ホストとして主にヤギ、ロバ、ウサギが用いられます。また抗体メーカーによっては、その他の動物種由来の二次抗体も入手が可能です。

主要タイプの二次抗体は、標的動物由来の免疫グロブリンのプールに対して産生されています。例えば、ヤギをホストとしてマウスIgG抗原の二次抗体(ヤギ抗マウスIgG抗体)を作成した場合、この2次抗体は、全クラスのマウス抗体に結合します。マウスIgG(H&L)やIgGフラグメント、また同一のドメインを有するその他の分子[ 例：IgGとκ(kappa)軽鎖を共有するIgMなど] にも結合します。一方、ヤギをホストとしてマウスIgG1抗体抗原の二次抗体を作成した場合、この二次抗体はマウスIgG1抗体、もしくは同じドメインを有する分子にしか結合しません。

多くの免疫グロブリンドメイン構造中には高度に共通している領域が存在しています。そのためクラス特異的な二次抗体の産生には、他の免疫グロブリンとの交差反応を最小限に抑えるために、アフィニティ精製と交差吸着処理（cross-adsorption）を行う必要があります。具体的な例を挙げると、マウスIgG1に結合するすべてのヤギ抗体をアフィニティー精製するために、固定化したマウスIgG1抗体を使用します。これらの抗マウスIgG1抗体を、マウスIgG2a/ IgG2b/ IgG3/ IgM等を含むクロマトグラフィーカラムに通過させて、さらに精製します。その結果、IgG1以外のアイソタイプと交差反応する抗体を除去することができます。

さらに、2次抗体は、抗体作成の際のホスト以外の生物種由来の血清タンパク質を固定化したカラムを用いて、追加の精製を行うことも可能です。この精製は、交差吸着( cross-adsorption)と呼ばれるオプション精製になります。ホストの異なる複数の一次抗体を使用した場合や、サンプル中に免疫グロブリンやその他の血清タンパク質が含まれる場合は、交差吸着した二次抗体の使用をお勧めします。

二次抗体はクラスや生物種特異性だけでなく、抗体断片(F(ab')1、Fab)、もしくは各抗体鎖(μ、γ、κ)や各抗体ドメインに対する精製も行えます。下表は、二次抗体の特異性を表す一般的な表記法です：

実験の目的によって、二次抗体の特異性が高すぎてしまったり（例：一次抗体に対して1種類のホスト生物種由来しか認識しない）、逆に二次抗体の特異性が低すぎてしまう場合もあります（例： 全IgG/ IgGフラグメントを認識してしまう）。実験システム設計を詳細に行い、適切な二次抗体が選択できれば、こうした問題のほとんどは解決できます。下記の点に従って、二次抗体を選択してください：

1. 一次抗体のホストの生物種を決定する(マウス抗チューブリン、ウサギ抗CD4、等)
2. 二次抗体に対して適切なホストの生物種を選択する（ヤギ抗マウスIgG、ロバ抗ウサギIgG）
3. 二次抗体の交差反応性や特異性に注意してください：
   • Highly cross-absorbed（交差吸着）– 複数の標識を行う用途、もしくは内因性抗体と共にサンプルの検出を行う場合
   • 特異性 – 一次抗体の適正な断片/クラス/鎖に結合する
4. 検出法や精製法
   • 標識 – 検出法に適正な酵素/タグ/蛍光団へ適切に結合する
   • プロテインA/プロテインG/プロテインLへの結合能力 – 使用する二次抗体が、上流や下流で用いる分子に対して十分にアフィニティーがあることをご確認ください(例：プロテインAでコーティングされたマイクロプレート)
5. 二次抗体の形状に注意してください：
   • 二次抗体の形状：二次抗体は液体状態または凍結乾燥状態で提供されます。また抗体によって、PBSに溶解されていたり、Tris-bufferに溶解されていたりと様々です。さらにキャリアタンパク質としてゼラチンやアルブミンが添加されていたり、スクロースや微生物阻害剤が添加されているものもあります。