ウェスタンブロットのストリッピング法とリプロービング法

化学発光検出法は、メンブレンから結合物を除去して同一膜で検出できるという利点があります。化学発光に使用される生成物は、着色沈殿物や膜吸着蛍光分子よりも剥がれ易いため、化学発光を使用することにより試薬類を完全に膜から除去できます。数回の膜のストリッピングとリプロービンによって、他のタンパク質の可視化やタンパク質検出の最適化(抗体濃度)が行えます。

膜を適切にストリッピングするためには、(大量の抗原が膜から遊離しないように)抗体を抗原から遊離させる条件で行います。このために、通例界面活性剤・還元剤・加熱処理・低pHなどを組み合わせた、様々なプロトコルが開発されています。ストリッピングでは、ある程度の抗原が膜から剥離されます。穏やかな条件下で抗体をストリッピングすることによって、抗原の損失を最小限に抑えることが重要です。各抗体-抗原ペアにはそれぞれ固有の特性があるため、抗原を保持したまま抗体を完全に除去できるといった手法は存在しません。

ストリッピングの後、膜を試験して検出試薬が完全に除去されたこと確認する必要があります。膜を数回洗浄し、ブロッキングします。そして二次抗体とインキュベートした後、化学発光基質と再度インキュベートします。ストリッピングで一次抗体が有効に除去されていれば、二次抗体は膜に結合せず、シグナルは一切生成されません。バンドがまだ膜上にみられる場合、ストリッピング条件を強くしてください。反応時間や温度を上昇させるだけで、通常はストリッピングの検討ができます。しかし、ストリッピングバッファ成分を変更する、もしくは手法そのものを完全に変更する必要がある場合もあります。