タンパク質学について私達が知る限りでは、タンパク質とアフィニティーリガンドの固定化には、様々なクロマトグラフィー樹脂やビーズ、膜、プラスチックまた他の固形または多孔性材料がなければ不可能です。これらのツールおよび方法は研究の主要な目的ではなく、むしろ完了のための手段であるため、研究者はプロセスに用いる相対分子、高分子および物理的なスケールについて見落としがちです。タンパク質精製および検出のベースとなる化学反応の研究者達は、スケールについて誤った認識をしてしまいがちです。例えば、次の図（図1）は、抗体の固定化における化学反応について参考になりますが、同時に、反応内の構成要素の相対的寸法について大きな誤解を招いています。

固定化メカニズムの主な特徴を示すために、官能基とビーズ状の担体を圧縮していますが、実際の官能基の分子サイズは6桁近くあります。（表1）。図2は、低ナノメートル領域の直径を有する高分子を用いて処理する場合の正確なサイズを表しており、ミクロン領域の直径を有する多孔質樹脂と比較できます。この図では、個々の官能基や原子は見えません。固定化された高分子の約百分の一の大きさしかないからです。

表 1。固定化アフィニティーリガンドの図における官能基の相対的な大きさ。

図2。 アガロースビーズおよび抗体（タンパク質）の相対的なサイズについての図。

この図と対比して、リガンドのロードおよび結合性能を示す実際のスペックがあり、調製アフィニティー樹脂に対する固定化リガンドやタンパク質の濃度を示しています。通常これらは、アガロース樹脂のミリリットル（mL）あたりのリガンドの結合量（milligrams、mg）またはリガンドの結合濃度（micromoles、µmolまたはnanomoles、nmolの場合もあります）として表されます（表2 ）。

表2。任意のアガロースアフィニティー樹脂のロードおよび/または結合性能の例。

値は製品のクレームやテストスペックで、1mLのアフィニティーカラムへの充填と同様、ビーズのミリリットル当たりの値で示されています。詳細はそれぞれの製品ページを参照ください。

固定化アフィニティー樹脂に含まれる分子と物理的サイズを正確に把握したい思う研究者にとって、リガンドのロード値と結合容量が各分子数とサイズにどのように関係しているかを計算することは有益です。以下のような質問に答えるために必要な計算を本文に提示します：

• 単一アガロースビーズの量はいくらですか？
• 樹脂1ミリリットル中にアガロースビーズはいくつありますか？
  （充填された樹脂のミリリットル当たりのアガロースビーズの数はいくつですか？）
• アガロースビーズ当たりの官能基はいくつありますか？
  （ビーズ当たりの官能基の数はいくつですか？ ）
• いくつの抗体またはタンパク質分子が、アガロースビーズに結合していますか？
• いくつの抗体またはタンパク質分子が1つのアガロースビーズに結合可能ですか？

樹脂のミリリットル当たりのアガロースビーズの数

濃度から（例えば、ビーズの1mL当たりのμgリガンド）ビーズ当たりのリガンド分子の数へ変換するための最初のステップは、充填された樹脂の1ミリリットル当たりのビーズの数を決めることです。この値は、細胞を数える方法と同じやり方で実験的に決めるのが理想的です：測定された量のビーズに従来の希釈を行い、その後、顕微鏡でサンプル内のビーズを数えます。私達はこの測定方法による公開された結果を見つけることができませんでした。従って私達のアプローチは、ビーズの平均量を計算し、その後、sphere-packing理論をベースとして、1ミリリットルの樹脂中のこれらのビーズの数を推測します。

1. アガロースビーズの直径は45～165µmです。
   • ビーズは100μmの直径の球体であると仮定しましょう​​。
   • つまり、ビーズの平均半径は50μm= 0.05mm= 0.005cmになります。
2. 従ってビーズの量は：
   • 球体の体積 = (4/3)πr³
   • 半径 = 0.005cm、単一ビーズ量 = 5.236 x 10^-7cm³ = 5.236 x 10^-7mL
   • かなり小さなピペッターではその量は0.524nLです！
   • 従って全てのビーズ数において、各ビーズ量は0.047nL（半径45μmのビーズ）～2.3nL（半径165μmのビーズ）になります。
3. Sphere-packing 理論：
   • spheres packの効率は65〜75％であることを数式は示しています(>)。
   • ビーズ状アガロースは、ビーズサイズの混合物であり、ビーズは完全な球形でもなく個体でもありません；このようにsphere-packingの理論は、指定された量の粒子数の正しい値について、ただ概算を提供するだけかもしれません。しかし私達の目的には、それで十分です。
   • つまり75％のpacking効率を仮定すると、実際には0.75mLの量のビーズで、約1mLのbed volumeを形成することになります（例えば、カラム中に1mLの樹脂）。
4. 最終計算：
   • 1mL当たりのビーズの数：
   • = 0.75(1 bead/5.236 x 10^-7mL)
   • = 1.432 x 10⁶ beads/mL of bed
   • = 樹脂1ミリリットル当たりに約140万個のビーズ

アガロースビーズ当たりの官能基または反応基の数

1. 活性化樹脂が充填樹脂1mL当たりで10～100µmolの グループを有するよう生成されました。
   • 例えば、 CarboxyLink Resinは充填ビーズ（樹脂床）1mL当たり16～20μmolのアミンを有するように生成されました。
   • 私達はbed volume1mL当たり、わずか1μmolの計算を行います (= 1 x 10^-6mol)。
   • すると分子の数は、アボガドロ数を乗じたモル数に等しくなります：(1 x 10^-6mol) x (6.02 x 10²³) = 6.02 x 10¹⁷ 1ｍLbed volume 樹脂当たりの分子。
2. 最終結論:
   • 1mLbed volume当たりの1μmolのアフィニティーグループ：
   • = (6.02 x 10¹⁷  1ｍLved volume当たりのグループ) / (1.432 x 10⁶ 1ｍLbed volume当たりのビーズ)
   • = 4.204 x 10¹¹ ビーズ当たりのグループ
   • = アガロースビーズ当たり約4200億グループ
3. 従って:
   • 樹脂1mL当たりでビーズが20～40μmolの反応基を含むと考えられる通常の活性化について、以下のことが十分言えます：
   • アガロースビーズ当たりに、何兆という数の活性基があります。

アガロースビーズ当たりの固定化された抗体分子の数

1. 通常、活性化樹脂のタンパク質結合性能は実験例を用いて決められます （マウスまたはウサギ全IgGを用いることが多い）。通常、これらの結合性能は樹脂1mlあたりマイクログラムまたはミリグラムのタンパク質として表されます。
   • 例えば実験により、1mLのAminoLink Plus Coupling Resin (Part No. 20501)は97％の効率で4.7mgのマウスIgGを固定化できることが示されています。これは、樹脂1mL当たり4.5mgのIgGが効果的に結合されることになります。
   • 樹脂1mL当たりで実際に結合した1mgのIgGの計算をしましょう。
   • IgGのMW = 150,000g/mol；従って、1mgIgG 　= 6.67 x 10^-9mol
   • このモル量にアボガドロ数をかけた数は、樹脂1mL当たりの4.01 ×10¹⁵IgG分子に等しいです。
2. 最終計算：
   • 樹脂1mL当たりの1mg IgG：
   • = (4.01 x 10¹⁵ 樹脂1mL当たりのIgG分子) / (1.432 x 10⁶ 樹脂1mL当たりのビーズ)
   • = 2.80 x 10⁹ ビーズ当たりのIgG分子
   • = アガロースビーズ当たり約30億個の抗体分子
3. 従って:
   • 通常のタンパク質固定化について以下のことが十分言えます、
   • アガロースビーズ当たり十億のタンパク質分子が結合

アガロースビーズ当たりの結合タンパク質分子の数

1. 共有結合などの結合性能は通常、アフィニティー樹脂1ミリリットル当たりに結合したミリグラムのタンパク質ターゲットとして表されます。
   • 例えば、Thermo Scientific HisPur Ni-NTAとCobalt Resins は、10～50mg/mLのHis-taggedタンパク質と結合します。His-GFP（ 27kDa ）を用いてテストします。
   • 樹脂1mL当たりのHis- GFP融合タンパク質の10mgの計算をしましょう​​。
   • His-GFP-GFP MW = 27,000g/mol；従って、His-GFP 1mg = 3.7 ×10 ^-8mol
   • このモル量にアボガドロ数を乗じた値が、樹脂1mL当たりの2.23 ×10¹⁷ His- GFP分子に等しいです。
2. 最終計算:
   • 樹脂床1mL当たりのHis-tagged融合タンパク質10mg:
   • = （樹脂1mLあたりの2.23 x 10¹⁷ His-GFP 分子） / （樹脂1mLあたり1.432 x 10⁶ ビーズ）
   • ＝ビーズ当たり1.56 x 10¹¹ His-GFP分子
   • = アガロースビーズ当たり1560億His-GFP 分子
3. 従って：
   • 多くのタンパク質精製について以下のことが十分言えます、
   • アガロースビーズに何億個のタンパク質分子が結合します

アフィニティー精製について個々のアガロースビーズレベルで正確に視覚化しようとしたときに、他に考慮すべき重要な事柄があります。アガロースビーズは硬い固体ではなく、不浸透性でもありません；むしろメッシュ状構造の多孔性エアロゲルで、らせん構造の緩く織り合わされた多糖鎖からなります。従って、リガンドと標準的なタンパク質分子は、マトリックス内に拡散し、アガロースビーズ全体を通じて付着・結合できます。言い換えれば、付着は表面部分に限りません。

標準的な4％または6％のビーズアガロース樹脂のビーズ（多くのサプライヤーから入手可能）は、直径サイズ45〜 165μmで、これは抗体や他のタンパク質の球状タンパク質の長さ・幅の約5000 〜50,000倍に相当します。共有結合固定化方法についての図は、カップリング反応の化学的根拠を説明するのには有益ですが、官能基の相対的なサイズや数については誤解を招いています。いくつかの簡単な計算を用いて、私達は必要な単位を変換して、例となる濃度値（活性化レベル、ローディングレベル、カップリングと結合能力）を個々のアガロースビーズ当たりの分子数として表しました。Perhaps for most researchers, knowing these values satisfies merely academic curiosity and provides little practical value.However, we suggest that it is generally helpful for scientists to maintain accurate perceptions about the molecular dynamics of laboratory methods.

結果のまとめ:

• 4％または6％ビーズアガロース担体において、個々のアガロースビーズは平均して、1ナノリットルの約半分（ 0.52nL ）の量の球形のビーズを有しています。
• アガロース樹脂1mLにおいて、約150万の個々のアガロースビーズがあります。
• 共有結合固定化に使用された標準的な活性化アフィニティー担体において、個別のアガロースビーズは何兆 (1 x 10¹²)もの官能基または反応基（例えば、アルデヒド、アミン、 NHSエステル等）を含んでいます。
• タンパク質精製における標準的なアフィニティー担体において、個々のアガロースビーズは何十億 (1 x 10⁹)の標的分子（例えば、タンパク質、抗体等）と相互作用または結合することができます。

表 3。ビーズ状アガロース担体の計算値のまとめ。