安定同位体標識ペプチドは、酵素で消化されたタンパク質サンプルの質量分析（ MS ）定量化における内部標準として日常的に使用されています。しかしながら、安定同位体標識タンパク質は、MSサンプル調製損失と消化効率の変動をコントロールするため、より良好な標準と考えられています。¹⁵N-labeled E. coliまたはSILACのような¹ 従来のin vivo 発現系（つまり、細胞培養中のアミノ酸を用いた安定同位体標識）は 、組換え重タンパク質の発現に使用されています； しかしながら、これらのシステムは、毒性または不溶性のタンパク質の発現に限定され、タンパク質発現に2〜3日必要で、機能的なタンパク質の収量が少ない可能性があります。また、in vivo 系は、安定同位体標識細胞株を使用するため、セル内の全てのタンパク質が同位体標識され、無駄が多くコスト高になります。

In vitro翻訳（IVT）は代替タンパク質発現方法で、細胞抽出システムを用いてDNAをmRNA に転写し、その後タンパク質に翻訳します。ほとんどのIVT系は、原核生物（例えば、細菌）または非ヒト真核生物（例えば、ウサギ網状赤血球）細胞抽出物を使用します；² しかしながら、これらのIVT系は適切なフォールディングやヒトタンパク質の修飾に必要な成分が欠けており、発現率が低く、また安定同位体標識アミノ酸の結合は非効率です。本研究では、定量的な質量分析（MS）のための安定同位体標識タンパク質標準の発現に、Thermo Scientific 1-Step Heavy Protein IVT Kit (Part No.88331)を使用しました。

1-Step Heavy Protein IVT Kitは、新しいヒト無細胞溶解物^3,4を用いて、安定同位体標識タンパク質を迅速に発現します（図1 ）。組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて、タンパク質の発現および重アミノ酸濃度を最適化しました。重アミノ酸で補充されたHeLa細胞溶解物を用いた、滴定実験および経時変化実験により、1mM以上のアミノ酸濃度、および4時間以上のインキュベーションが、最適なタンパク質発現と> 90％の安定同位体結合に必要であることが示されました（図2Aおよび図2B ）。重アミノ酸または軽アミノ酸で捕捉された溶解物においてGFPタンパク質発現の差はありませんでした（データ非掲載） 。

図 2。 重緑色蛍光タンパク質の発現。 パネルA： GFPが20時間発現し、重アルギニン（Arg10）およびリジン（Lys8）の量が増加し、図1に示す通り分析されました。 Panel B: GFP発現の時間と対応する重同位体の結合を示します。

ヒト組換えタンパク質生産のための、ヒト重IVTシステムを検証するため、6つの組み換えタンパク質を発現させ、GSTまたは6xHisアフィニティー精製を用いて精製しました。ウェスタンブロットにより示されるように、全てのタンパク質が発現されましたが（図3A ）、6つのタンパク質のうち4つのみが、精製やサンプル調製後に高収率で回収されました。重ペプチドおよび軽ペプチドのMS分析で測定されるように、全ての発現タンパク質は、90％以上の安定同位体結合がありました（図3Bおよび図4）。

図4。 in vitro翻訳により発現するヒトタンパク質は高い同位体結合を有します。 パネルA： 安定同位体標識GAPDHペプチドAGAHLQGGAkの質量分析スペクトル。 パネルB: 安定同位体標識サイクリンD1ペプチドAYPDANLLNDrの質量分析スペクトル。

理想的なタンパク質標準は、それらの内因性対応物と一致するものです。ヒト無細胞抽出システムにおける組換えタンパク質の発現により、適切なタンパク質フォールディングおよび翻訳後修飾をサポートできます。² 一つのヒトタンパク質、Bcl-2結合死促進因子 (BAD)の精製中、重タンパク質を有する light 14-3-3σが同時に精製されるのを確認しました (図 5A)。このタンパク質間の相互作用は、セリン/トレオニンリン酸化モチーフの14-3-3結合を介して行われることが知られています（図5B ）。⁵ IVT -発現タンパク質のMS分析により、4つのAktコンセンサスリン酸化部位のうち、3 つを同定しました (図5C)。全体的にこれらの結果は、このヒト無細胞発現系を用いて発現された組換えBADは、機能的なタンパク質修飾と相互作用を有していることを示します。

1-Step Heavy Protein IVT Kitを用いて、> 90％の同位体を8時間未満混入して、6つの異なる完全長の、安定同位体標識ヒトタンパク質を迅速に発現しました。このシステムを用いて発現した重タンパク質は、機能的なタンパク質修飾および相互作用を有し、内因性タンパク質定量の理想的なMS標準となります。

タンパク質発現および精製:各遺伝子において、1-Step Heavy Protein IVT Kit (Part No. 88331)を用いて、全長cDNAがC末端融合タンパク質として発現しました。 C末端アフィニティータグに応じて、Thermo Scientific Pierce GST Spin Purification Kit (Part No. 16106) またはThermo Scientific HisPur Cobalt Purification Kit (Part No. 90091)を用いて、発現したタンパク質を精製しました。 精製タンパク質サンプルをSDS- PAGEで単離し、Thermo Scientific Pierce GelCode Blue Stain Reagent (Part No. 24590)を用いて染色しました。各タンパク質を含むゲルスライスを脱染、還元、アルキル化し、トリプシンを用いて4-16時間、ペプチドに消化させました。消化されたペプチドをThermo Scientific C18 Stage Tips (Cat # SP201)を用いて脱塩し、0.1％トリフルオロ酢酸を用いて凍結乾燥し、再構成しました。

同位体標識されたタンパク質を、安定同位体標識アミノ酸 ¹³C₆¹⁵N₂ L-リジン および¹³C₆¹⁵N₄ L-アルギニンで捕捉されたカスタムアミノ酸混合物を用いて、 IVT反応において発現させました。　特に注記のない限り、全ての反応を 8~16時間、30°Cでインキュベートしました。組換えHIS -GFPタンパク質の蛍光を、Tecan Safire*Fluorometerを有するGFP標準曲線を用いて測定しました。

LC-MS/MS 分析:Thermo Scientific PepMap C18 Column (75 µm ID x 20 cm) を有するNanoLC-2D 高圧液体クロマトグラフ (HPLC) を、ペプチドの分離に使用しました。5〜40％の勾配（水、 0.1％ギ酸; B ：アセトニトリル、 0.1％ギ酸）を、300nL /分の流速で40分間、使用しました。A Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL ETD Mass Spectrometerを、ペプチドの検出に使用しました。 単一ステージのMSからなるtop-six実験を行い、衝突解離（CID）を有する6つのMS / MSスペクトルを取得し、タンパク質同定の補助に使用しました。　

データ分析： Thermo Scientific Proteome Discoverer Software version 1.3およびSEQUEST* 検索エンジンを用いて、カスタムヒトSWISSProt データベースと一致するMSスペクトルを検索しました。静的修正には、メチオニン酸化を有するカルバミドメチルが含まれていました。リジン8とアルギニン10を動的修飾として用いました。SILAC比は、各重鎖および軽鎖ペプチドの濃度曲線下面積（AUC）に基づいており、安定同位体結合を決定します。

1. Hanke, S., et al.(2007).Absolute SILAC for accurate quantitation of proteins in complex mixtures down to the attomole level.J Proteom Res 7:1118-30.
2. Ciccimaro, E., et al.(2009).Absolute quantification of phosphorylation on the kinase activation loop of cellular focal adhesion kinase by stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry.Anal Chem 81(9):3304-13.
3. Mikami, S., et al.(2008).A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.Protein Expr Purif 62(2):190-8.
4. Stergachis, A., et al.(2011).Rapid empirical discovery of optimal peptides for targeted proteomics.Nat Meth 8(12):1041-3.
5. Tzivion, G., et al.(2001).14-3-3 proteins; bringing new definitions to scaffolding.Oncogene20(44):6331-8.

本文のデータは過去に、2012 American SocietyのMS年次総会、ポスター表題「定量的質量分析における、安定同位体標識タンパク質標準生成のための、ヒト無細胞発現システムの開発」で発表されました 。