アンドロゲン、成長因子、および転写因子を含む、多くの要因が、正常な、またがん性の前立腺発達および機能の調節に関係しています。アンドロゲン受容体（AR）は、正常な前立腺機能および生存の重要な調節因子です; しかし、ARはまた、前立腺がんの制御されない細胞増殖の誘導因子にもなります。このステロイド受容体は、そのリガンドである dihydroxytestoterone （DHT）の不在下で、熱ショックタンパク質とco-chaperones により、細胞質内に隔離されています。アンドロゲンが結合すると、シャペロンは解離し、ARは二量体化され、核移行シグナルが現れます。これは、 核への移行を可能にし、ARのアンドロゲン応答エレメント（AREs）への結合が可能になり、遺伝子発現の変動につながります（図１）。[Ref.1] ARへのDHT結合を介したシグナル伝達の進行が、アンドロゲン依存と呼ばれています。

図1。 アンドロゲン受容体の活性化に関与する経路。 テストステロンはDHTに変換され、アンドロゲン受容体（AR）に結合します。 その後、ARは二量化され、リン酸化され、核へ移動します。ここで、異なるアンドロゲン応答エレメント（AREs）に結合することができ、最終的に細胞寿命を増加させます。 LNCaP細胞内でARは変異し、弱いβエストラジオールの活性化を可能にし、テストステロンと同じ反応をいくつか行います。 EGFはEGFRに結合し、JAK/STAT3、PI3K/Akt および MEK/MAPK 経路を含む一連のタンパク質活性化をもたらします。 これらのアンドロゲン非依存性反応の一部は、逆に、 ARのリン酸化を可能にします。

前立腺がんの治療は、テストステロン遮断療法による腫瘍増殖の停止に関係する場合が多いです。しかし、この効果は一時的であり、前立腺がん進行におけるアンドロゲン非依存性経路についての研究の必要性が示されました。[Ref.2] これは非常に複雑な経路で、非アンドロゲン、前立腺細胞クローン選択、およびAR変異への適応に関係している可能性があります。今までの結果から、AR/DHT軸と成長因子シグナリングエフェクターの間のクロストークが、前立腺がん進行に寄与していることを示唆しています。上皮成長因子（EGF）およびその膜受容体（EGFR）の両方が進行期の前立腺がんにおいて頻繁にアップレギュレートされています。[Ref.3] 多くの翻訳後修飾は、アンドロゲン受容体で起こっており、それにはリン酸化、アセチル化、 SUMO化、メチル化、およびユビキチン化が含まれます。[Ref.1] EGFRシグナリングエフェクターの多くは、これらの修飾の一部の要因である可能性があります。

ここでは、テストステロン、 βエストラジオール、およびEGF刺激によるアンドロゲン感受性前立腺がん細胞株LNCaPへの影響を調べました。ウエスタンブロットを用いて、増殖経路の活性化/抑制を、ARタンパク質レベルと共に示しました。クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを介して、非アンドロゲン刺激（ βエストラジオールとEGF）により、ARがいくつかの遺伝子の既知のアンドロゲン受容体要素（AREs）に結合するかどうかを調べました: 前立腺特異抗原(PSA)、 FK506 結合タンパク質 5 (FKBP5)、 インスリン様増殖因子 1 (IGF-1)、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 1A (CDKN1A)および 膜貫通型 プロテアーゼ、セリン 2 (TMPRSS2)。その結果、 MAPKやAKTなどの増殖経路は、EGF刺激により活性化され、テストステロンまたはβエストラジオールで処理された細胞では抑制されることが示されました。また、テストステロン処理により、ARのAREsへの結合が増加することがわかりました。

LNCaP細胞のアンドロゲンおよび非アンドロゲン刺激による影響を調べるため、テストステロン、 βエストラジオール、またはEGFを有する細胞を培養、処理し（図2 ）、様々なタンパク質および遺伝子の発現における変化を測定しました。　経路の活性を決めるため、処理した細胞を溶解し、全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを用いて、リン酸化特異的標的のpAkt 、pMAPK 、pCREB 、および pSTAT3とARタンパク質レベルを検出しました。また、テストステロン処理後のAR mRNAレベルを、RT-PCRでモニタリングしました。最後に、抗RNAポリメラーゼIIおよび抗AR抗体を用いてChIPを実施し、既知のAREsのタンパク質結合による影響を測定しました。

図2。 ARタンパク質発現および遺伝子制御における、アンドロゲンおよび非アンドロゲンエフェクターを確認するための実験ワークフロー。 LNCaP細胞をテストステロン、 βエストラジオール、またはEGFを用いて増殖、処理しました。 全タンパク質およびRNAを抽出して、タンパク質や転写レベルでのタンパク質発現の変化を評価しました。 また細胞をクロスリンクさせて、ChIP、そしてqPCRを実行して、転写レベルでの遺伝子制御への影響を測定しました。 詳細はMethods セクションを参照。

この結果により、テストステロン処理によりpAkt活性が徐々に増加することが示されました。しかし MAPKおよびCREBのリン酸化レベルは抑制されました (図 3A)。この研究によりMAPKの不活性化だけでなくAKTの活性化により、LNCaP細胞がアポトーシスから保護され、細胞の生存が増えることが示されました。[Ref.4] ARタンパク質レベルは、テストステロン処理の2時間後に増加しました(図3A）。この結果により、テストステロン処理後、AR mRNAレベルが5倍に増加したことが確認され、タンパク質発現が、転写レベルで制御されたことが示されました (図 3B)。転写活性の増加はまた、PSAプロモーター領域を増幅してテストステロン処理した細胞を用いて、抗RNAポリメラーゼII抗体を使いChIPを実行することでも検証されました（図 3C）。ここでは、テストステロン処理より、PSAプロモーター領域へのRNAポリメラーゼのリクルートメントが約3倍になりました。これは早い反応で、2時間のテストステロン処理の後、正常レベルに戻ります。これは前立腺がん患者においてPSAレベルが上昇している原因の可能性があります。

図 3。 テストステロンによるARのアップレギュレーションは、AR依存の標的遺伝子の転写活性を増大させます。 (A) 全細胞溶解物のウェスタン分析を、ターゲットとテストステロン処理と共に示しました。 (B) AR mRNAレベルのRT -PCR分析を、制御細胞に対する濃度の倍率で表しました。 (C) PSAプロモーターの転写活性を、通常のIgGに対する濃度の倍率で示します。 (D) ARターゲットを示し、転写活性を通常のIgGに対する濃度の倍率で示します。

また、抗AR抗体を用いてChIPを行い、この転写調節因子の既知のAREsと異なる結合を調べました（図 3D）。その結果、テストステロンによりARのPSA遺伝子への結合は54倍、CDKN1A プロモーターへの結合は26倍、 TMPRSS2 ARE への結合は58倍、FKBP5 AREへの結合は300倍に増加したことが示されました（図3D および 表 1）。ほとんどの場合、これはテストステロン処理後の最初の30分間に発生した高速反応で、その後、処理から2時間で低いレベルに戻りました。テストステロン処理した細胞におけるFKBP5 ARE へのAR結合の大きな増加により、FBP51タンパク質のレベルが変わった可能性があると推測されます。これは逆に、AR co-chaperoneとして知られるFKBP1などの、ARの核移行に影響を与える可能性があります。[Ref.5] テストステロンはTMPRSS2のプロモーター領域へのAR結合を増加させる可能性があります。このプロモーターは、転写因子の赤芽球変換固有（ETS）ファミリーのコード領域と融合 し、悪性前立腺がんにつながる可能性があることが報告されているからです。[Ref.6]

表 1。 AR依存の標的遺伝子の相対的転写制御。各刺激薬とターゲット時点における値が、制御に対する倍濃度における差です（ゼロ時点）。

LNCaP細胞は変異ARを有し、弱いβエストラジオール活性化を可能にするため、βエストラジオールによる経路活性化および転写活性への影響も調べました（図 4）。MAPKおよびCREBを不活性化し、βエストラジオール処理によりARタンパク質レベルを上げました。この結果はテストステロン処理で確認されたものと同程度でした；しかしテストステロンとは異なり、 βエストラジオールは AKTを活性化することができませんでした （図 4A）。ChIPを用いて、βエストラジオールによる既知のAREsへのAR結合の影響も測定しました （図 4B）。βエストラジオールを用いた処理により、PSA、CDKN1AプロモーターおよびFKBP5 AREへのAR結合が若干増加しました。βエストラジオールにより、TMPRSS2 ARE へのAR結合は75倍、IGF-1プロモーターへの結合は15倍増加しました。しかし、テストステロンと比較すると、 βエストラジオールは影響が少なかったです。

図4. βエストラジオールはAR-依存ターゲットの転写を強力に活性化することができませんでした。 (A) ターゲットおよびβエストラジオール処理を有する全細胞溶解物のウェスタン分析を示します。 (B) AR-依存ターゲットの転写活性を、通常のIgGに対する濃度の倍率として示します。

最後に、非アンドロゲン刺激薬EGFによる経路活性化および転写活性への影響を調べました （図 5）。予想通り、EGF処理により JAK/STAT3 、PI3K/AKT およびMAPK経路が迅速に活性化されましたが、ARタンパク質レベルは変わりませんでした（図 5A）。EGF処理によりPSAプロモーターへのAR結合が12倍減少しました。FKBP5 AREと同様、CDKN1AとIGF-1プロモーターは若干の影響を受け、ARE含有遺伝子の制御の非アンドロゲン刺激薬の役割を示しました （図 5B）。

本研究において、テストステロン処理におけるAKTを除いて、ステロイドは通常の増殖経路を活性化しませんでした。テストステロン処理された細胞は、mRNAトランスクリプトおよびタンパク質レベルでのARにおいて増加を示しました。ARタンパク質レベルも、βエストラジオール処置によりわずかに増加しました。予想通り、EGFはJAK/STAT3、PI3K/AKTおよびMAPK経路を迅速に活性化しました。テストステロン処理のみが、PSAプロモーターへのAR結合を強力に活性化しました（βエストラジオールやEGFよりも5 〜10倍；表1）。テストステロンもまた、転写を活性化するためのPSAプロモーターへのRNAポリメラーゼIIのリクルートが可能でした。テストステロン処理した細胞におけるFKBP5 AREへのAR結合は、コントロールの細胞と比較して300倍の濃度でした。FKBP5をウエスタンブロッティング法によりテストステロンの影響によるタンパク質レベルを測定するのは興味深いです。テストステロンまたはβエストラジオールで処理した場合、TMPRSS2 AREへのARの結合はそれぞれ、コントロールを超える60倍と75倍に増加しました。βエストラジオールがなぜTMPRSS2プロモーターへの強力なAR結合を引き起こすのかは不明であり、より多くの研究が必要です。

前立腺がんの進行は、アンドロゲン依存性および非依存性のプロセス間の相互作用に依存しています。細胞タイプや刺激により、独立した経路が増殖や進行、あるいは抑制となる可能性があります。ここでは、細胞シグナル伝達現象、転写活性、およびmRNAレベルの制御を、テストステロン、 βエストラジオール、およびEGFで処理したLNCaP細胞を用いて調べました。高感度かつ最適化された磁気性のChIPキットにより、処理中の転写活性の違いを調べることができました。

細胞培養および処理

LNCaP（ATCC 、CRL-1740）細胞を10％ のFBSを含むRPMI-1640培地中で、5％の CO ₂を用いて37°Cで、80 ％のコンフルエントになるまで培養しました。次いで、10％の活性炭処理済みFBSを含むフェノールレッドフリーRPMI-1640中で、細胞を48時間培養しました。細胞をテストステロン（10nM、30分および2時間; Sigma）、βエストラジオール（10nM、4時間;　Sigma）、EGF（100ng/mL、15分および4時間；Cell Signaling Technology)で処理し、または未処理のコントロール細胞として残しました。

ウエスタンブロット法分析

細胞を上記の通り処理し、冷却TBSで2回洗浄しました。洗浄した細胞を、Pierce IP Lysis Buffer (Part No. 87788) を用いて、プレート上で溶解しました。それには1X Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail、 EDTA-free (Part No. 78441)が含まれます。全タンパク質をPierce 660nm Protein Assay (Part No. 22660)を用いて定量しました。ウエスタン分析で、各サンプルの全タンパク質30μgを、4〜20％のトリス-HCl SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、PVDF膜に転写しました。膜をStartingBlock T20 (TBS) Blocking Buffer (Part No.37543) を用いてブロックし、4 ℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートしました。 膜を適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体(Part No. 31430 および 31460)と共にインキュベートしました。バンドをSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Part No. 34080)を用いて検出しました。使用した一次抗体: β-actin (Ab No. MA1-744)； pAKT、 PKA、 pMAPK、 pCREB および pAKT (Cell Signaling Technology)；および PI3K ( BD Biosciences)。

RNA抽出および逆転写の全て

細胞を、上記の通りテストステロンで処理し、冷却TBSで2回洗浄しました。全RNAをTRIzol™ Reagent (Life Technologies)を用いて抽出し、1µgをSuperScript™ III Reverse Transcriptase (Life Technologies)を用いて逆転写しました。qPCRでは、最後のcDNAを1μL使用しました。

クロマチン免疫沈降

細胞を上記の通り処理しました。各処理において１つのプレートの細胞数をカウントして、総細胞数を測定しました。残りのプレートを最終濃度1％のホルムアルデヒドを用いてプレート上で10分間、室温で架橋し、250mMのグリシン（最終濃度）で5分間、室温でクエンチしました。ChIPの反応、4 × 10 ^ 6の各細胞は、Pierce Magnetic ChIP Kit (Part No. 26157) および以下の抗体を用いて二通り実施しました：AR (4.5µg、 Millipore)、 RNAポリメラーゼII (10µL、Part No. 26157から)およびnormal rabbit IgG(1.5µg、Part No. 26157から)。qPCRでは、最後のDNA1μLを使用しました。

定量PCR

定量的PCRをThermo Scientific™ Luminaris™ Color HiGreen qPCR Master Mixを用いて、Thermo Scientific™ Piko-Real™ Real-Time qPCR System上で三通り実施しました。　データは濃度の倍数、すなわち、バックグラウンド（通常のIgG抗体）を超えるシグナル（特異的抗体） として表されます。分析は[delta][delta] Cq法で実施しました。最初に標準化してインプットし、その後、式を使用しました：Net Cq = [Cq 特異抗体] – [Cq 標準 IgG]。Cqは定量サイクルとして定義。蛍光がバックグラウンドを越える場合のサイクル数。濃度の倍数の決定に、次の式を使用しました：倍濃度 = 2^-Net Cq。

qPCRプライマーシーケンス

AR プロモーター:

• Forward 5’ AAGAGCCGCTGAAGGGAAACAG 3’
• Reverse 5’ AGCATCCTGGAGTTGACATTGG 3’

PSA プロモーター:

• Forward 5’ TCTGCCTTTCTCCCCTAGAT 3’
• Reverse 5’ AACCTTCATTCCCCAGGACT 3’

FKBP5 ARE:

• Forward 5’ GCATGGTTTAGGGGTTCTTGC 3’
• Reverse 5’ AACACCCTGTTCTGAATGTGGC 3’

TMPRSS2 ARE:

• Forward 5’ TGGTCCTGGATGATAAAAAAGTTT 3’
• Reverse 5’ GACATACGCCCCCACAACAGA 3’

IGF-1 プロモーター:

• Forward 5’GGGCACATAGTAGAGCTCACAAAATG 3’
• Reverse 5’ TGAGTCTTCTGTGTGGTTAATACATTG 3’

CDKN1Aプロモータープライマーは、SA Biosciences社から購入しました。

1. Wang、 X、 et al.(2007).Targeted treatment of prostate cancer.J Cell Biochem 102:571-579。
2. Coffey、 K and Robson, CN.(2012).Regulation of the androgen receptor by post-translational modifications.J Endocrin 215:221-237
3. Zhu, ML and Kyprianou, N. (2008).Androgen receptor and growth factor signaling cross-talk in prostate cancer cells.Endocri Relat Cancer 15:841-849.
4. Lin, HK, et al.(2003).Suppression versus induction of androgen receptor functions by the phosphatidylinositol 3-kinase/akt pathway in prostate cancer LNCaP cells with different passage numbers.J Biol Chem 278:50902-50907.
5. Tai, PK, et al.(1986).A 59-kilodalton protein associated with progestin, estrogen, androgen, and glucocorticoid receptors.Biochem 25:5269-5275.
6. Li, Y, et al.(2011).Inactivation of AR/TMPRSS2-ERG/Wnt signaling networks attenuates the aggressive behavior of prostate cancer cells.Cancer Prev Res 4:1495-1506.

本研究は、最初にポスターとして発表されました：

Smith, S.M, et al.(April 10, 2013).Androgen-independent regulation of cellular signaling, transcriptional activity, and mRNA stability in a cell model of prostate cancer.American Association for Cancer Research Annual Meeting, Washington, D.C. (Abstract No. 5454).