脱塩精製やアフィニティー精製に利用できるThermo Scientific Pierce Chromatography Cartridgesは1mL、5mLサイズがあり、マニュアル操作、または自動液体クロマトグラフィー(LC)システムで処理できます。カートリッジは、ÄKTA *またはFPLCシステムに直接接続でき、追加のコネクタは不要です。カートリッジ製品にはチューブフィッティングと Luer-Lok**フィッティングのアクセサリーパック(別売)があり、他の一般的なLCシステムおよびマニュアルでのシリンジ処理でもご利用いただけます。カートリッジは個別に使用することも、または複数繋げて、より大きなカラム容量にすることも可能です(表 1; 図 1)。

表 1。Pierce Chromatography Cartridgeの性能

推奨流量および最大流量の目安;個々の製品により値は若干異なります。

特徴1mL カートリッジ5mL カートリッジ
寸法0.7 x 2.7cm1.3 x 3.8cm
脱塩精製 流量
(最大)
0.2 ~ 1mL/分
(3mL/分)
1 ~ 5mL/分
(8mL/分)
アフィニティー精製 流量
(最大)
0.1 ~ 1mL/分
(4mL/分)
0.5 ~ 2mL/分
(5mL/分)
最大圧力0.3 mPa (43 psi または 3 bar)0.3 mPa (43 psi または 3 bar)
カートリッジの材料ポリプロピレンポリプロピレン
フリットの材料ポリプロピレンポリプロピレン
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図 1。 Pierce Chromatography Columnsのスケール図。 72dpiでご覧の場合、この図は実際のサイズで表示されます。

本文に、Pierce Chromatography Cartridgesフォーマットにおける任意の脱塩およびアフィニティーカラムにおける性能データ(得られた分画のクロマトグラムおよび染色ゲル)をまとめました。これはThermo Scientific Zeba Desalting Resin (7K MWCO)、 Pierce Protein A Plus Agarose、Pierce Protein G Agarose、Melon Gel Support、HisPur Cobalt Resin および HisPur Ni-NTA Agaroseを有するカートリッジを含みます。他の樹脂もPierce Chromatography Cartridgesとして利用可能で、Pierce Glutathione Agaroseを含みます (サイドパネルの関連製品リンクを参照)。

結果と考察

脱塩カートリッジ

Zeba Desalting Chromatography Cartridges、7K MWCO は独自の高性能ゲル濾過樹脂により、他の市販の樹脂に比べて非常に優れた脱塩およびタンパク質回収率が得られます(図 1)。非常に希薄な(25μg/mL)タンパク質サンプルを正常に処理し、塩および他の小分子(< 1000Da)を95%以上保持(除去)することが可能で、タンパク質および他の高分子(> 7000Da )の回収率が高いです。カートリッジにより、迅速で簡単に、再現可能なクロマトグラフィー分離ができます。再生して繰り返し使用可能で、50~1500μLのサンプルを効率的に処理できます。

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図 2。 Desalting Chromatography Cartridgeによる効率的な塩除去およびタンパク質回収。  1MのNaCl内のウシ血清アルブミン (1mg)を、5mLのThermo Scientific Zeba Desalting Cartridge (Part No. 89935) に、(A) 5mL/分の流量でアプライ。 均一濃度ので溶出されたBSA(青)と、導電率により検出されたNaCl(茶色)を示しています。 95%以上のBSAを回収し、95%以上の塩を除去しました。 Thermo Scientific Pierce Cartridge (A) の結果は、より高価なGE Healthcare (B) およびBio-Rad (C) 製品の結果と変わりありませんでした。

Protein Aカートリッジ

Thermo Scientific Pierce Protein A Plus Agaroseは天然のProtein Aで構成されており、高品質にクロスリンクされた6%ビーズアガロース上に高密度に共有固定されています(CL-6B)。Pierce Chromatography Cartridgesは様々なサイズと種類のカラムとキットで構成され、このアフィニティー樹脂を使用できます。

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図 3。 同等の抗体収量および純度が、Protein A Chromatography Cartridgeで得られます。 PBSに正常ヒト血清(60mg)を懸濁し、1mL Thermo Scientific Pierce Protein A Cartridge (Part No. 89924) (A)および1mL GE Healthcare HiTrap* HP Column (B)にアプライし、 0.1Mグリシンを用いてpH2.8、1mL/分の流量で溶出しました。 矢印は、低pH溶出の開始を示します。 ヒトIgGの収量は、それぞれ 6.85mgと6.88mgでした​​。 分画をSDS- PAGEによって分離し、ゲルをImperial Protein Stain (Part No. 24615)で染色しました。 M = MW マーカー、 L = サンプル泳動、 FT = フロースルー および E = 溶出。

Protein Gカートリッジ

Thermo Scientific Pierce Protein G Agarose は精製されたリコンビナントのProtein Gが高品質の6%ビーズのアガロース(CL-6B)へ、高密度に共有結合で固定されています。Pierce Chromatography Cartridges は様々なサイズと種類のカラムとキットで構成され、このアフィニティー樹脂を使用できます。

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図 4。 同等の抗体収量および純度が、Protein G Chromatography Cartridgeで得られます。 PBSに正常ヒト血清(60mg)を懸濁し、1mL Thermo Scientific Pierce Protein G Cartridge (Part No. 89926) (A)および1mL GE Healthcare HiTrap* HP Column (B)にアプライし、 0.1Mグリシンを用いてpH2.8、1mL/分の流量で溶出しました。 矢印は、低pH溶出の開始を示します。 分画をSDS- PAGEによって分離し、ゲルをImperial Protein Stain (Part No. 24615)で染色しました。 M = MW マーカー、 L = サンプル泳動、 FT = フロースルー および 溶出 = 溶出画分。

Melon gel cartridge

Thermo Scientific Melon Gel IgG精製樹脂およびキットにより、血清および様々なサンプルタイプからの抗体の精製が可能です。Melon Gel Resinは血清タンパク質を結合・除去し、それにより純粋なIgGのフロースルー分画内における回収を可能にします。 穏やかな条件で溶出していただけます。パッケージおよびキットは、自然落下カラム、スピンカラムまたはクロマトグラフィー・カートリッジを使用した精製に利用可能です。

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図 5。 Melon Gel Cartridgesを用いた効果的なリバースアフィニティーの抗体精製。 正常ヒト血清(1mL)を、1mL Thermo Scientific Melon Gel Cartridge (Part No. 89932) に1mL/分の流量でアプライしました。 タンパク質混入物は樹脂に結合し、抗体はフロースルー(FT)します。 抗体の回収量 = 4 ~ 5mL。 Regeneration (R) solution stripsにより結合したタンパク質混入物が取り除かれるため、カートリッジは複数回利用可能です。 単離された抗体の純度をSDS -PAGE (右図)により評価し、GelCode Blue Stain Reagent (Part No. 24590)で染色しました。 M = MW マーカー、 L = 泳動サンプル、 FT = フロースルー および R =再生画分。

HisPur cobalt cartridge

Thermo Scientific HisPur Cobalt Resin製品は、二価のコバルト(Co2 +)を四座配位でキレートするアガロースサポートにより、様々なサンプルタイプからヒスチジンタグ融合タンパク質を特異的に迅速かつ穏やに精製します。Ni-IDAと四座配位のNi2 +キレート樹脂を比較すると、Co2 +樹脂は高い特異性(少ないオフターゲット結合)でHisタグタンパク質に結合し、穏やかな条件(低濃度のイミダゾール)で溶出できます。

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図 6。 HisPur Cobalt Cartridgeを用いた、E. coli 溶解物からの6xHis -GFPの精製。 Hisタグ緑色蛍光タンパク質(GFP)を、Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free (Part No. 78415)を含むThermo Scientific B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer (Part No. 78266) を用いて、E. coli から抽出しました。 平衡/洗浄バッファー(50mMのリン酸ナトリウム、 300mMの塩化ナトリウム、10mMのイミダゾール、 pH7.4)を用いて、溶解物を1:1に希釈し、1mLの HisPur Cobalt Chromatography Cartridge (Part No. 90093)に 0.3mL/分の流量でアプライしました。 カートリッジを、平衡/洗浄バッファーを用いて、吸光度のベースラインがA280に達するまで洗浄しました。 HisタグGFPを溶出(50mMのリン酸ナトリウム、 300mMの塩化ナトリウム、 150mMのイミダゾール;pH7.4)し、選択した画分をSDS-PAGE およびThermo Scientific GelCode Blue Stain Reagent (Part No. 24592)を用いて分析しました。 M = MW マーカー; S = 非分画溶解物; FT = フロースルー。

HisPur Ni-NTAカートリッジ

Thermo Scientific HisPur Ni-NTA Resin は Hisタグ融合タンパク質をアフィニティー精製に利用するニッケルIMAC樹脂です。特別に調製されたアガロースビーズは、キレートリガンドとしてニトリロ三酢酸(NTA)が結合しており、二価ニッケルイオン(Ni2+)をとともにサンプルをアプライすることで効率的に結合します。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)樹脂は、組換えHisタグタンパク質の精製において非常に優れた結合能力および性能をもたらします。

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図 7。 HisPur Nickel-NTA Cartridgeを用いたE. coli 溶解物からの6xHis-GFPの精製。 過剰発現の6xHis-GFP (緑色蛍光タンパク質)を含む細菌溶解物(130mgの全タンパク質)を平衡バッファーを用いて1:1に希釈し、1mL HisPur Ni-NTA Chromatography Cartridge (Part No. 90098) に1mL/minの流量でアプライしました。 カートリッジをPBS、 68mMのイミダゾールで、吸光度のベースラインに達するまで洗浄しました。 6xHis-GFPをPBS、300mMのイミダゾールで溶出しました。 溶出を280nm(青線;total protein)および485nm (赤線; GFP-specific)で確認しました。 選択した画分をSDS- PAGEにより分析しました。 ゲルレーンを同量で標準化しました。 M = MW マーカー、 L = 溶解物泳動、 FT = フロースルー および E = 溶解。
方法

ここに記述した実験は、2010年に行われたHisPur Ni-NTA実験(図7 )以外、2007年に行われました。全てのクロマトグラフィー実験は、 ÄKTA *システム(GE Healthcare)を用いて行いました。



    Zeba Spin Desalting Columns

    Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO 75µL は独自の高性能サイズ分画クロマトグラフィー樹脂を含むポリプロピレン製のカラムで、遠心フォーマットにおいて優れたタンパク質脱塩および回収を行います。

    Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO 75µLの特徴:

    • 高い回収率—低結合の樹脂でタンパク質の回収を最大化
    • 迅速性—分画スクリーニングや自然落下による溶出の待ち時間がない
    • 使い易さ—面倒なカラム調製や平衡が不要
    • 柔軟性—様々なニーズのスピンカラム、フィルタースピンプレートとカートリッジに利用可能
    • 経済的—他の市販のカートリッジよりも低コストで高パフォーマンス

    非常に希薄な( 25μg/ mL)タンパク質サンプルにおいて、塩および他の小分子(< 1000MW)の95%以上を保持(除去)し、タンパク質と他の高分子(> 7000 MW)を効率的に回収することが可能です。

    Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columnsの詳細

     

    For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.