複雑な細胞シグナル経路の研究では、強力で特殊なツールが、遺伝子活性化または抑制の変化をモニターするために必要です。こうしたプロセスを正確にモニターするために、レポーター遺伝子アッセイが一般に使用されます。当社の遺伝子制御の研究向けマルチプレックスルシフェラーゼは、他社のルシフェラーゼレポーターシステムより鋭敏で便利に作られています。弊社では、2種の天然に分泌されるルシフェラーゼ遺伝子を使用しています。ガウシアルシフェラーゼは、海生カイアシ類であるGaussia princepsに由来し、ウミホタルルシフェラーゼは、海生貝虫であるCypridina noctilucaに由来します。このガウシア-ウミホタルデュアルシステムは組織培養用培地中のプロモーター2個の転写調節を、細胞溶解なしで行うことが可能です。更に、ガウシアとウミホタルルシフェラーゼの双方が従来のホタルルシフェラーゼレポーターよりかなり明るく光ります。

当社ではLuciola cruciata (日本のゲンジボタル) 由来で赤色にシフトした発光スペクトルを有するホタルルシフェラーゼ突然変異体と、スペクトル分解可能な発光を示すCypridina (ウミホタル)ルシフェラーゼを組み合わせたデュアルスペクトルのルシフェラーゼアッセイもご提供しています。このウミホタル／赤色発光ホタルデュアルスペクトルアッセイは、2つの基質を加えて発光スペクトルを解析することで、シングルリードアッセイで2つのプロモーターを同時にモニターします。レポーターとコントロールの組み合わせは、実験レポーターとコントロールのルシフェラーゼ活性を、基質試薬の添加またはクエンチを2段階で行う必要なく、同時にモニターします。ルシフェラーゼ反応で生じる生物発光シグナルはルミノメーターで捕捉します。生じたシグナルは産生したルシフェラーゼタンパクの量に比例し、これはルシフェラーゼ発現プロモーターの転写活性に比例しています。

Thermo Scientific Pierce Luciferase Assayの有用性を示すため、低分子アゴニストに対するNF-kappa B（NFkB）およびCREプロモーター活性の変化をモニターしました。ウミホタル/赤色発光ホタルのスペクトル分離マルチプレクシング、ガウシア/ウミホタルマルチプレックスアッセイを使用しました。2種類分泌されたガウシア/ウミホタルルシフェラーゼアッセイは培地中NFkBおよびCREレポーター活性のリアルタイムモニタリングができ、フィルターベースの検出により同時に検出できます。

NFkBまたはCREB結合DNA配列の複数タンデムコピーを、Thermo Scientific pMCS-CypridinaまたはpMCS-Gaussia Mammalian Expression Vector（図1）にクローンしました。Thermo Scientific pCMV-Red Firefly Mammalian Expression Vectorはウミホタルおよびガウシアシグナルを標準化する恒常的ルシフェラーゼシグナルとして用いられます。赤色発光ホタルルシフェラーゼによるATP依存的なルシフェリン酸化では、最大613 nmの発光が見られ、ウミホタルルシフェラーゼによるヴァルグリン酸化では最大463 nmの発光が見られます（図2、表1）。ウミホタルおよび赤色発光ホタルルシフェラーゼ活性はフィルターベースアッセイで同時に測定しました。当アッセイでは、ウミホタルルシフェラーゼプラスミドは実験レポーターとして働き、赤色発光ホタル発現プラスミド（CMV-red firefly）は標準化コントロールとして使用されます。

哺乳類の細胞で発現させる場合、高レベルのガウシアルシフェラーゼが細胞培養用培地に分泌され、レポーター活性の生細胞モニタリングが可能になります。NFkB-Cypridinaレポータープラスミドから発現したウミホタルルシフェラーゼ活性は、TNFα濃度が上昇するにつれて上昇しました（図3A）。同様に、CRE-Gaussiaレポータープラスミドから発現したガウシアルシフェラーゼ活性はフォルスコリン濃度が上昇するにつれて上昇しました（図3B）。この結果は、同じ細胞中にある2種の特徴的なパスウェイの活性化を同時に検出する能力を示しています。

図3 スペクトルが分離しているルシフェラーゼレポーターを使用した複数シグナル伝達経路の同時検出。 HEK293細胞をフォルスコリンまたはTNFα1つのみまたは組み合わせて、cAMP媒介CREBパスウェイまたはNFkB媒介細胞生存経路を活性化する。 手順書に従って、ルシフェラーゼ活性はPierceルシフェラーゼアッセイキットを使用して決定した。 発光シグナルは、CMV-red fireflyコントロールプラスミド由来の赤色発光ホタルルシフェラーゼ活性に標準化した。

CREBおよびNFkBレポーター活性のリアルタイムモニタリングを、培地中の分泌型ルシフェラーゼ活性の測定により行いました。フォルスコリン添加の3時間後、細胞をTNFαで処理し、NFkB-CypridinaLucレポーターを活性化しました。実験中、細胞培養用培地から2時間間隔でサンプルを採取しました。細胞培養用培地の分泌型ガウシアおよびウミホタルルシフェラーゼをモニターしました。両レポーターは時間経過につれて誘導倍率が増加しました（図4）。NFkBおよびCREレポーターの特徴的な活性化を、細胞を破壊することなくリアルタイムで観察しました。

Pierceルシフェラーゼアッセイキットは、細胞内または分泌型ルシフェラーゼ活性を、哺乳類の細胞培養培地においてプロモーターから検出する、またはパスウェイを活性化する非常に感度が高いシステムです。こうしたアッセイはNFkBおよびCREBシグナル導入経路の同時リアルタイム検出を、スペクトルが分離しているルシフェラーゼレポーターを用いて細胞を破壊することなく可能にします。

細胞培養用培地：HEK293細胞をDMEM/高グルコース培地に10%ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を添加して培養します。細胞は96ウェル組織培養プレートに10,000細胞/ウェルでプレーティングし、トランスフェクション前に加湿型細胞培養インキュベーターで37℃、24時間インキュベートしました。

トランスフェクション：CRE-Gaussia、NFkB-Cypridina、CMV-red fireflyのプロモーター遺伝子コンストラクトを含むプラスミド（図1）を、Thermo Scientific TurboFect Transfection Reagent（品番R0533）を使用してコトランスフェクトし、HEK293細胞に変換しました。24時間トランスフェクションした後、細胞をフォルスコリンまたはTNFα1つのみまたは組み合わせて、cAMP媒介CREBパスウェイまたはNFkB媒介細胞生存経路を活性化します。

ルシフェラーゼアッセイ：ウミホタルおよび赤色発光ホタルルシフェラーゼの活性をPierce Cypridina-Firefly Luciferase Dual Assay Kit（品番16183）を用い、手順書に従って決定しました。ガウシアルシフェラーゼの活性はPierce Gaussia Luciferase Flash Assay Kit（品番16158）で決定しました。生物発光シグナルは、試薬インジェクター、480±20 nmバンドパスフィルター、640 nmロングパスフィルターを備えたThermo Scientific Varioskan Flashルミノメーターを使用して検出しました。NFkB-CypridinaまたはCRE-Gaussiaレポータープラスミドから発現したウミホタルまたはガウシアルシフェラーゼ活性をCMV-red fireflyコントロールプラスミド由来の赤色発光ホタルルシフェラーゼ活性で標準化しました。

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