プロテアーゼおよびホスファターゼは多くの代謝機能および調節機能にかかわっています。しかし、細胞溶解時には、放出された酵素が、大量のタンパク質の分解および脱リン酸化を引き起こします。細胞または組織の溶解後、プロテアーゼおよびホスファターゼ活性の影響を受けずにタンパク質を保持することは、多くの研究用途で必要不可欠です。Thermo Scientific Pierceプロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤混合のタブレットは、細胞溶解およびタンパク質抽出におけるタンパク質分解や脱リン酸化を広範囲に渡り防ぐのに最適な製剤です。

プロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を加水分解する一般的な酵素類です。プロテアーゼは、切断部位に基づいて2つの広いカテゴリーに分けられ、さらに活性部位およびpH指向に基づいて分けられます。エキソペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼ）は基質のアミノ末端またはカルボキシ末端に近位のペプチドを切断し、エンドペプチターゼ（セリン、アスパラギン酸、システインおよびメタロプロテアーゼ）は基質の末端から遠位のペプチドを切断します。プロテアーゼの分布は植物(44%)が最も大きく、次いで細菌(18%)、真菌(15%)、動物(11%)、藻類(7%)およびウイルス(4%)と続きますが、プロテアーゼの多様性、分布および分画化は生物によって異なります。

Phosphatases are hydrolase enzymes that remove phosphates from proteins and other molecules. The balance of phosphorylation/dephosphorylation is vital to many cellular signaling pathways, including signal transduction, cell division and apoptosis. Phosphatases are categorized based on sequence, structure, and catalytic function. Protein phosphatases generally target serine, threonine and tyrosine phosphorylation during cell signaling. Acid phosphatases are localized in acidic lysosomes, and alkaline phosphatases are active in more basic cellular environments. The phosphatases are also ubiquitous, but depending on function, are preferentially concentrated in certain cell types and tissues.

We evaluated the effectiveness of the Pierce Protease, Phosphatase, and the combination Protease and Phosphatase Inhibitor Tablet formulations using a variety of protease and phosphatase substrates. We compared tablet performance to tablets from other suppliers. Our formulations protected proteins from protease and phosphatase degradation and performed favorably compared to other commercial preparations.

プロテアーゼ阻害

プロテアーゼアッセイは、一般的なプロテアーゼ基質が個々の阻害活性の関与を真に評価していないという点で、いくぶん結果を攪乱しています。同様に、各製剤は同じ抽出源、調製およびタンパク質濃度などの同じ条件を用いて比較されなければなりません。多くの蛍光性基質を評価し、システインプロテアーゼ（パパイン）およびセリンプロテアーゼ（トリプシン）のアッセイ基質を選択しました。ポジティブコントロールはマウス膵臓抽出物(1 mg/ml)を使用しました。選択したシステインプロテアーゼ基質は切断により460 nmの蛍光を認め、セリンプロテアーゼによる切断では520 nmの蛍光が得られました。

We compared protease inhibition by the Pierce Tablet formulations (Table 1) to other commercial formulations. Our tablet formulation nearly completely inhibited papain activity (98% and 94% inhibition) in pancreatic extracts and performed better than other commercial formulations (Figure 1). Tablet formulations inhibited approx. 80% of serine protease activity. Similarly, the tablets inhibited > 90% of papain activity in different cell lines and tissues lysates (Figure 2).

A.

B.

図2. タブレット製剤は、様々な組織ライセートおよび細胞株のプロテアーゼ活性を阻害する。 細胞および組織ライセートのプロテアーゼ活性(1 mg/mL)を、調製済みPierceプロテアーゼ阻害剤タブレットの非存在下または存在下で測定した。 プロテアーゼ阻害のパーセントを示す。

ホスファターゼ阻害

ホスファターゼ阻害剤タブレットの有効性を評価するため、リン酸化された標的タンパク質のウェスタンブロットを実施し、酸、アルカリおよびタンパク質ホスファターゼ用のアッセイを用いてホスファターゼ活性を評価しました。血清飢餓培養後にPDGFで活性化し（図3A）、調製済みの阻害剤タブレットの存在下で溶解したNIH 3T3細胞から、リン酸化されたAKTおよびPDGFを検出しました。さらに、阻害剤で保護してホモジナイズした組織中に、リン酸化されたERK1/2を検出しました（図3B）。本結果から、阻害剤存在下で細胞溶解を行うことで、リン酸化物を保持できることが示されました。

To assess phosphatase activity, the tablets were reconstituted and incubated with mouse brain extract and fluorescent phosphatase substrates. Cleavage of the phosphate results in fluorescence at 528nm. Our phosphatase inhibitor tablets were able to inhibit 91% of the protein phosphatases, 71% of the acid phosphatases, and 95% of the alkaline phosphatases activities (Figure 3C).

図3. タンパク質リン酸化は細胞内または組織抽出物で保持される。 ホスファターゼ阻害剤の非存在下または存在下で、調整されたタンパク質抽出物からの総タンパク質とリン酸化タンパク質の相対量を調べたウェスタンブロット分析。 パネルA：血清飢餓状態にしたAKTおよびPDGFR、PDGF (100 ng/mL)で活性化したNIH 3T3細胞抽出物。 パネルB：肝臓および脾臓の組織抽出物中のERK1/2。 パネルC：Pierceホスファターゼ阻害剤タブレットまたは他の市販のホスファターゼ阻害剤タブレットで処理後、マウス脳抽出物中のタンパク質ホスファターゼ活性、酸性ホスファターゼ活性、アルカリホスファターゼ活性が阻害される程度を測定した。 阻害のパーセントを示す。

混合型のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害

プロテアーゼおよびホスファターゼの両方を阻害するように調合したPierce阻害剤タブレットの有効性を評価するため、マウス脳抽出物中のプロテアーゼおよびホスファターゼ活性を測定しました。混合タブレット製剤は、酵素活性のほとんどを阻害することができました。EDTA製剤は、わずかに有効性が高く、プロテアーゼ活性の87%、ホスファターゼ活性の96%を阻害しました（図4）。本研究の時点で、比較の対象になり得る市販の混合タブレットはありませんでした。

Pierce阻害剤タブレットを用いることにより、タンパク質サンプル調製時における細胞のプロテアーゼおよびホスファターゼに対する優れた保護が達成されました。混合タブレットは、プロテアーゼおよびホスファターゼの両方に対する保護を提供する唯一の市販タブレット製剤です。本タブレットはバイアル入りで提供され、最大限の保護を得るためには、使用する直前に溶解します。

細胞株および組織の溶解：HEK293、A549およびHepG2細胞株は、ATCCガイドラインに準じて培養されました。細胞溶解については、細胞を培養密度80～90%になるまで増殖させ、氷冷PBSでリンスした後、阻害剤の使用または非使用条件下で氷冷したThermo Scientific M- PER哺乳類タンパク質抽出試薬（品番78501）を用いて細胞を溶解させました。ライセートはチューブに移し、氷上で10分インキュベートし、10,000 x gで10分遠心することで調製しました。上清は使用するまで-80°Cで保存しました。阻害剤の使用または非使用条件下でThermo Scientific T-PER組織タンパク質抽出試薬（品番78510）中でポリトロンを用いて凍結組織(Pel-Freez Biologicals)をホモジナイズしました。ライセートは、10,000 x gで10分遠心することにより精製しました。上清は使用するまで-80°Cで保存しました。

膵臓抽出物の調製：ホウ酸バッファー(pH 8.5)中でホモジナイズした5～6匹分の凍結マウス膵臓を用いて抽出物を調製し、15,000 x gで10分遠心することにより精製しました。上清を回収し、Thermo Scientific Pierce 660 nmタンパク質アッセイ試薬（品番22662）を用いてタンパク質濃度を測定し、新鮮なうちに使用または直ちに凍結しました。

Cysteine Protease Inhibition: Inhibitor tablets were reconstituted according to the manufacturer’s instructions. Fluorescent papain substrate (100µM final) was coated onto black, 96-well microplates. Protease inhibitor (1X final) and pancreatic extract (diluted in borate buffer to 1mg/mL) was added to the plates and incubated for 1 hour at 37°C. Activity was measured using a Thermo Scientific VarioSkan Flash Plate Reader (excitation/emission: 380/460nm). The percent protease inhibition is indicated for each protease inhibitor formulation. Percent inhibition was calculated relative to the wells that contain substrate and extract without inhibitor tablet solution. Samples were assayed in at least triplicate.

Serine Protease Inhibition: Inhibitor tablets were reconstituted according to the manufacturer’s instructions. A mixture of protease inhibitor tablet solution (50µL, 3X), trypsin solution (50µL, 0.1 U/µL), and protease substrate solution (50µL) are added into a 96-well microplate. Reactions were incubated for 2 hours at 37°C and the fluorescence intensity was determined at Ex490/Em520nm using a Thermo Scientific VarioSkan Flash Plate Reader. The percent protease inhibition is indicated for each protease inhibitor formulation. Percent inhibition was calculated relative to the wells that contain substrate and trypsin solution without inhibitor tablet solution. Samples were assayed in at least triplicate.

Phosphatase Assays: Tissue extract was prepared using frozen mouse brain. Two brains were homogenized in Thermo Scientific T-PER Tissue Protein Extraction Reagent (Part No. 78510) and clarified by centrifugation for 10 minutes at 10,000 x g. Supernatants were collected and protein concentration was determined using the Pierce 660nm Protein Assay Reagent and either used fresh or immediately frozen. Inhibitor tablets were reconstituted in water. Fluorescent acid, alkaline or protein phosphatase substrate (MFP, FDP and FDP, respectively) was coated onto black 96-well microplates. Protease inhibitor (1X final) and brain extract (diluted in assay sample buffer to 0.4mg/mL) were added to the plates and incubated for 1 hour at 37°C. Activity was measured using a VarioSkan Flash Plate Reader (excitation/emission: 485/528nm). Percent inhibition was calculated relative to the wells that contained substrate and extract without inhibitor. Samples were assayed in at least triplicate.

Cell Culture and Growth Factor Stimulation: NIH 3T3 cells were grown to near confluency in DMEM/high-glucose media supplemented with sodium private, sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. The cells were washed with HBSS, and media was replaced with reduced serum media (1% FBS) and incubated for 48 hours at 37°C. Cells were stimulated with 100ng/mL of PDGF (Cell Signaling Technology, Inc.) for 10 minutes. Cells were lysed using M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Part No. 78501) with or without phosphatase inhibitors. Lysates were clarified by centrifugation for 10 minutes at 15,000 x g. Supernatants were collected and protein concentration was determined using the Pierce 660nm Protein Assay Reagent.

Western Blotting: For each condition, 20µg of lysate was used to detect AKT, pAKT, PDGF, pPDGF, ERK1/2 and pERK1/2. After transfer onto nitrocellulose, membranes were blocked with 5% bovine serum albumin in Tris-buffered saline with 0.1% Tween*-20, and incubated overnight at 4°C with the primary antibodies. Signal was detected using the appropriate HRP-conjugated secondary antibodies, Thermo Scientific SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Part No. 34080) and exposure to film for 2 minutes.

Bull, H., et al.(2002).Acid phosphatases.Diagn Mol Pathol 55:65-72.

Mahajan, R.T. and Badgujar, S.B.(2010).Biological aspects of proteolytic enzymes: A review.J Pharmacy Research 3(9):2048-68.

Millan, J.L. (2006). Alkaline phosphatases: Structure, substrate specificity and functional relatedness to other members of a large superfamily of enzymes. Purinergic Signal 2:335-341.

Stoker, A.W. (2005). Protein tyrosine phosphatases and signaling. J Endocrinol 185(1):19-33.