生物学的治療の開発において、エンドトキシンの除去は炎症、組織死、エンドトキシンショックの予防に重要です。ポリミキシンBをエンドトキシン除去に使用する従来の樹脂は、結合効率が低いです。重力落下クロマトグラフィーを使用すると、樹脂とエンドトキシンを含むサンプルとの接触時間が長くなり、結合が向上します。ほとんどの生体サンプルと同じく、処理時間を最小限にすることがタンパク質分解、変性、凝集によるサンプルの分解を防ぐために重要です。

本研究の目的は、非常に迅速にエンドトキシンをサンプルから除去し、その結果高いタンパク質収量を実現する方法を生み出すことです。ポリ-ε-リシンがリポ多糖（エンドトキシン）に親和性があるにもかかわらず、生体サンプルにそれを使用する合理的な手順はありませんでした。Thermo Scientific Pierceエンドトキシン除去樹脂はポリ-ε-リシンで固定化された球状の硬いビーズからなるアフィニティ樹脂です（図1）。この樹脂は、環境に優しい天然高分子であるセルロース、および食品保存料としてFDAの認可を受けたポリ-ε-リシンで構成されています。樹脂を評価するため、サンプルのインキュベーション時間、樹脂-サンプル比、最大エンドトキシンのロード量、樹脂再生能力を試験しました。また、樹脂を他社のエンドトキシン除去方法と比較しました。

FDAのガイドラインでは治療材料中のエンドトキシンユニット(EU)レベルは体重1 kg当たり5 EU/mL以下でなければならないと指示しています。エンドトキシンレベルを10,000 EU/mLから5 EU/mL以下に下げるために必要なインキュベーション時間を決定するため、10,000 EU/mLを添加したウシ血清アルブミン(BSA)サンプルを用いて異なるインキュベーション時間でレベルを測定しました。樹脂と30分間インキュベーションすると、エンドトキシンレベルは5 EU/mL未満に低下し、その後エンドトキシンレベルはわずかに低下しました（図2）。さらに、1時間のスピンプロトコルの限界を決定するため、BSAサンプルを5,000～500,000 EU/mLのエンドトキシンレベルで試験しました。すべてのレベルで、エンドトキシンの除去率は98%を超えていました。しかし処理前濃度が50,000以上の場合、mL当たりの処理後エンドトキシンユニットはFDAガイドラインを上回りました（表1）。タンパク質の回収率は90%超でした。

表1. エンドトキシンは汚染度の高いサンプルから効率的に除去されます。 エンドトキシンを添加したBSA（1 mg/mL濃度で2 mL）サンプルを、Pierce高容量エンドトキシン除去スピンカラム(0.5 mL)で処理しました。 Inital Endotoxin Concentration (EU/mL) Final Endotoxin Concentration (EU/mL) Endotoxin Removal Efficiency (%) 5000 < 1 99.98 12,500 < 1 99.99 25,000 1.26 99.99 50,000 7.1 99.99 250,000 32 99.98 500,000 9600 98.08

効率的なエンドトキシン除去に最適な樹脂-サンプル比を決定するために、10,000 EU/mLを含む様々な容量のBSAをPierce高容量エンドトキシン除去樹脂に加えました。サンプル容量が樹脂容量と等量(1:1)のときは、1時間のインキュベーション後に処理後エンドトキシンレベルは10 EU/mLより大きくなっていました。エンドトキシンレベルを効率的に5 EU/mL未満まで低下させるには、樹脂-サンプル比は最低1:2が必要です（表2）。

表2. 樹脂-サンプル比はエンドトキシン除去の効率性に影響します。 10,000 EU/mLを含む様々な容量の1 mg/mL BSAを、様々な容量のPierce高容量エンドトキシン除去樹脂を含むスピンカラムで処理しました。Resin Volume (mL)Sample Volume (mL) Resin-to-sample Ratio Final Endotoxin Concentration (EU/mL) 1 1 1:1 > 10 1 2 1:2 < 5 1 4 1:4 < 1 1 8 1:8 < 1 0.5 0.5 1:1 > 10 0.5 1 1:2 < 5 0.5 4 1:8 < 1 0.25 0.25 1:1 >10 0.25 0.5 1:2 < 5 0.25 1 1:4 < 1

他社の樹脂も評価しました。Pierce高容量エンドトキシン除去樹脂は試験した他社の樹脂より効率的にエンドトキシンを除去しました。さらに、ほとんどの他社製樹脂でタンパク質の損失が大きいという結果になりました（表3）。

表3. Thermo Scientific Pierce高容量エンドトキシン除去樹脂は他社製の樹脂より効率的でした。25,000 EU/mLを含むBSAサンプル（1 mg/mLの2 mL）をメーカーの指示に従って指定された樹脂で処理しました。Resin/SourceFinal Endotoxin Concentration (EU/mL) Protein Recovery (%) Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin< 191 Thermo Scientific Detoxi-Gel Enotoxin Removal Gel 77 74 Affi-Prep* Polymyxin Matrix (Bio-Rad) 13 88 Polymyxin B-Agarose (Sigma) 900 63 ReductEtox* (Sterogene) 13,900 92 EndoTrap* red (Hyglos) 64 82

エンドトキシン除去樹脂はよく再使用され、他のサンプルを汚染するリスクを排除するため、クリーンアップステップが必要です。複数回の再生後の樹脂の性能をモニターするため、5サイクルのエンドトキシン除去および樹脂再生を2時間または12時間（一晩）のプロトコルで行いました。Pierce高容量エンドトキシン除去樹脂は95%エタノール中0.2 M NaOHを使用して2時間で、またはエンドトキシンフリー水中0.2 M NaOHを使用して12時間で再生できます。すべての試験を通して、エンドトキシン除去率は99%超（表1）、タンパク質回収率は85%超（表4）でした。

表4. エンドトキシン除去樹脂は複数回の再生後も効率性を維持します。 10,000 EUを添加したBSA（1 mg/mLで1 mL）を含むサンプル。各サイクルおよび処理の処理後エンドトキシン濃度は1 EU/mL未満でした。Regeneration CycleProtein Recovery (%) 12 hour Protocol Protein Recovery (%) 2 hour Protocol 1 96 88 2 91 86 3 89 89 4 88 90 5 89 88

Pierce高容量エンドトキシン除去樹脂は効率的にサンプル中のエンドトキシンレベルを低減し、市販されている他の方法より優れた結果を示します。スピンカラムフォーマットは除去プロセスを迅速にし、BSAサンプルからの効率的な除去を30分間のインキュベーションで可能にします。しかし標準プロトコルではインキュベーションは1時間で、サンプルの種類によっては必要な場合があります。樹脂は安定で、性能が劣化することなく最低5回は再利用できます。従って、サンプルのエンドトキシンレベルが処理後に許容限度を超えている場合、樹脂は再生できサンプルはもう一度処理できます。

エンドトキシン除去：樹脂を含むスピンカラムを500 x gで1分間遠心分離にかけ、保存バッファーを除去しました。カラムを0.2 N NaOH（一晩）または95%エタノール中0.2 N NaOHで1～2時間洗浄した後、2 M NaCl、エンドトキシンフリー水の順でさらに洗浄しました。樹脂の平衡化は、エンドトキシンフリーなリン酸緩衝生理食塩水で3回行いました。サンプルを加え、穏やかに転倒混和しながら4～22°Cで30分～1時間インキュベーションしました。カラムを500 ×gで1分間遠心分離し、試料を回収しました。他社の樹脂をメーカーの指示に従って使用しました。エンドトキシンレベルはThermo Scientific Pierce LAL発色性エンドトキシン定量キット（品番88282）を使用して測定しました。

サンプル-樹脂比：異なる容量のPierce高容量エンドトキシン除去樹脂を充填したスピンカラムを、リン酸緩衝生理食塩水（50 mMリン酸ナトリウム、0.15 M塩化ナトリウム、0.05%アジ化ナトリウム、pH 7.2）中に10,000 EU/mLを含む異なる容量の1 mg/mL BSAで検証しました。サンプルは1時間一定に混合してインキュベーションしました。タンパク質溶液は遠心分離で回収しました。エンドトキシンレベルはPierce LAL発色性エンドトキシン定量キットを使用して測定しました。

Resin regeneration: The Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin was used for multiple cycles of endotoxin removal and subsequent resin regeneration with 0.2M NaOH for 12 hours or 0.2M NaOH in 95% ethanol for 2 hours. Samples contained 1mL of BSA (1mg/mL) spiked with 10,000EU of E. coli strain 055:B5 in phosphate-buffered saline (10mM sodium phosphate, 0.15M sodium chloride, 0.05% sodium azide; pH 7.2). This cycle was repeated five times with each regeneration treatment. Endotoxin levels were measured using the Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit, and protein concentration was determined using the Pierce BCA Protein Assay (Part No. 23225).