シアル酸付加されたグリカンおよび糖タンパク質は、数多くの生理病理学の機構に関係しており、生物療法の開発用途に使用されています。質量分析(MS)は糖ペプチド分析において最も強力なツールとなっています。しかし、シアル酸付加された糖ペプチドは、得られる量が少なく、酸性および親水性の特性を有するため、その構造特性評価は分析的に困難なままです。原則として、シアル酸付加された糖ペプチドの目標とする濃縮は、サンプルから利用可能なすべての情報を抽出できる独自の能力を備えたMSを利用することで達成されます。濃縮はサンプルマトリックス全体の複雑性を大幅に減らすため、より感度の高い、精密な分析が可能となります。Thermo Scientific Pierce TiO₂リン酸化ペプチド濃縮およびクリーンアップキットは、複合体および分画されたタンパク質消化物から、シアル酸付加された糖ペプチドをMS分析用に効率的に単離することができます。

シアル酸付加の変化は成長、腫瘍生物学、および自己抗原性疾患や他の疾患に関連付けられており、また、シアル酸付加はバイオ医薬品の半減期およびin vivo¹での活性を有意に増加させることが示されています。負に荷電したシアル酸化糖ペプチドに対するTiO₂ の高い選択性は、これらの種の非常に特異的な結合をもたらします。このリン酸化ペプチド濃縮およびクリーンアップキットは、TiO₂スピンチップ、グラファイトスピンカラム、バッファーおよび使いやすいプロトコルを含んでおり、こうした構成品がリン酸化ペプチドの高収量をもたらし、MS分析がすぐにできるように糖ペプチドサンプルをクリーンにします。本キットは、当社の溶解、還元、アルキル化、消化などの試薬と互換性があるため、シアル酸付加された糖ペプチドの研究に完全なワークフローを提供することができます。

単一糖タンパク質のグリコシル化部位に関する包括的なプロファイリング

Efficient enrichment of sialylated N-linked glycopeptides using TiO₂ has been reported.^2,3 Graphite columns have affinity for glycopeptides with a smaller peptide backbone.⁴ To demonstrate the utility and specificity of TiO₂ for enriching sialylated glycopeptides, TiO₂ and graphite were used alone or combined for a two-step enrichment. This approach ensures all sizes of glycopeptides are enriched for analysis and compared against the most commonly used zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography (ZIC-HILIC)-based strategy. Bovine alpha-1-acid glycoprotein (AGP) was used as the model system for our method development because of its high glycan content, multiple glycosylation sites, and the presence of small glycopeptides. Additionally, this protein is well characterized in terms of glycosylation patterns, and extensive reference data are readily available in the literature.⁵ Comparison of the efficiency of various enrichment strategies was examined (Figure 1). Bovine AGP contains five N-glycosylation sites containing complex-type glycan structures, with a significant portion being highly sialylated multi-antennary. Of all the tested enrichment approaches, only TiO₂ alone or in combination with Tandem Mass Tag* (TMT*) Reagents and graphite columns enabled detection and identification of all five N-glycosylation sites and their multiple glycopeptide glycoforms.

図1. ウシAGP糖ペプチドの濃縮に関するZIC-HILIC対TiO₂対TMT-TiO2-グラファイト対グラファイトの比較

ヒト血清グリコプロテオームのシアリルグリコシル化部位に関する包括的なプロファイリング

複雑なサンプルを用いてTiO₂のパフォーマンスを試験するため、H2¹⁸O-PGN Faseで処理したヒト血清トリプシン消化物について調べました。ヒト血清に対する2つの濃縮方法（TiO₂対ZIC-HILIC）で得られた結果を図2に要約します。どちらの方法も、独自の糖ペプチドおよび糖タンパク質を多く有し、重複はわずか35%でした。整然とした糖ペプチドに関する当社の結果から、TiO₂ベン図に示された糖ペプチドはN結合型および酸性であったのに対し、ZIC-HILICでの独自の糖ペプチドは主にN結合型および中性であったという所見を確認することができました。

図2. ヒト血清糖ペプチドの濃縮に関するTiO2とZIC-HILICの比較

TiO₂ベースの濃縮方法に固有のシアル酸付加されたN結合型糖ペプチドを特定した実施例を図3に示します。ヒスチジンに富む糖タンパク質のシアル酸付加された糖ペプチドは、TiO₂ベースの濃縮方法でのみ特定されました。全体として、TiO₂とZIC-HILICは、相補的な濃縮方法を提供し、TiO₂はシアル酸付加された糖ペプチドを選択的に濃縮しました。

1. Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009).Edited by Varki, A. et al.Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp 199-218, 622-623, 722-724.
2. Takegawa, Y., et al. (2006). Simple separation of isomeric sialylated N-glycopeptides by a zwitterionic type of hydrophilic interaction chromatography. J Sep Sci 16:2533-40.
3. Larsen, M.R., et al. (2007). Exploring the sialiome using titanium dioxide chromatography and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 6:1778-87.
4. Larsen, M.R., et al. (2005). Characterization of gel-separated glycoproteins using two-step proteolytic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 4:107-19.
5. Treuheit, M.J., et al. (1992). Analysis of the five glycosylation sites of human alpha 1-acid glycoprotein. Biochem J 283:105-12.