Thermo Scientific ActivXセリンヒドロラーゼプローブはフルオロホスホネート（FP）基に結合したタグからなり、このFPタグ基が酵素活性を有するセリンヒドロラーゼのセリンを特異的かつ共有結合的に標識します（図1）^1~3。活性評価に加え、FPプローブは細胞ライセート、細胞内分画、組織および組換えタンパク質由来の酵素に対する低分子阻害剤をスクリーニングするのに使用できます。

図1. セリンヒドロラーゼプローブの構造および標識機構。 パネルA：標識された酵素の親和性濃縮または検出用のアジド、デスチオビオチンおよび蛍光フルオロホスホネート（FP）の構造。 パネルB：フルオロホスホネートプローブは、酵素活性を有するセリンヒドロラーゼの活性部位セリンを共有結合的に標識する。

活性部位プローブタグ基に応じて、FPプローブで標識された酵素は、ウェスタンブロット法、蛍光ゲルイメージングまたは質量分析法（MS）で検出および定量化することができます（図2）。TAMRA-FPプローブは、蛍光ゲルイメージング、キャピラリ電気泳動法または質量分析を用いてサンプル内のセリンヒドロラーゼ活性を標識および検出するのに使用できます³。アジド-FPプローブは、ホスフィンまたはアルキンで誘導体化されたタグと組み合わせ、検出または濃縮のいずれかに使用します。デスチオビオチン-FPプローブは、ウェスタンブロット法を用いて、標識されたタンパク質の活性部位の濃縮および検出の両方に使用することができます。

MSワークフローでは、標識されたタンパク質を還元し、アルキル化し、酵素で消化してペプチドにします。標識された活性部位ペプチドのみを、LC-MS/MS分析用に濃縮します。ウェスタンブロット法およびMSのいずれも阻害剤の標的への結合を把握するのに利用できますが、包括的な阻害剤の標的と非標的を同定できるのはMSワークフローのみです。

セリンヒドロラーゼプローブを用いた阻害剤プロファイリング

The serine hydrolase superfamily is one of the largest, most diverse enzyme families in eukaryotic proteomes.⁴ Serine hydrolases are generally grouped into two large 100+ member families: serine proteases (e.g., trypsin, elastase and thrombin) and metabolic serine hydrolases. Although many family members share a common catalytic active site, metabolic serine hydrolases are divided into multiple enzyme subclasses, including esterases, lipases, amidases and peptidases based on differences in structure, catalytic mechanism and substrate preference. Because many of the proteolytic enzymes in this family are expressed as inactive pro-enzymes (zymogens), active-site probes are advantageous for activity assessment, especially when compared with other expression profiling techniques that measure only abundance.

To demonstrate the utility and specificity of active-site probes for serine hydrolase activity profiling, mouse brain and liver tissue lysates were labeled with TAMRA-FP probe and analyzed by fluorescent gel scanning (Figure 3A). Using the fluorescent gel workflow revealed that lysates pretreated with protease (AEBSF) or hydrolase (URB597 and CAY10401) inhibitors had different inhibition patterns of TAMRA-labeled serine hydrolases compared to untreated control samples. Probe labeling was also specific for active serine hydrolases, as heat denatured samples had signal similar to unlabeled controls samples.

図3. マウス組織ライセートにおける、セリンヒドロラーゼプローブを用いた様々な阻害剤のスクリーニング。 パネルA：マウス脳または肝組織ライセート（50 μg）を、2 μM TAMRA-FPプローブと標識する前にDMSO（0）または100 μMセリンヒドロラーゼ阻害剤AEBSF（A）、URB597（U）またはCAY10401（C）で1時間前処理した。 標識されたタンパク質をSDS-PAGEで分離し、Typhoon* Imager（GE Healthcare Life Sciences）を用いた蛍光ゲル走査法により分析した。 プローブ標識の特異性を示すことを目的に、未標識ライセート（-）、および熱変性した（Δ）ライセートを対照群として用いた。 FAAHは矢印で示す。 パネルB：マウス脳組織ライセート（500 μg）をパネルAの場合と同様に前処理し、2 μMデスチオビオチン-FPプローブで標識した。 デスチオビオチン-FPで標識したタンパク質は、SDS-PAGE、および特異的なFAAH抗体を用いたウェスタンブロットを行う前に、変性させ、ストレプトアビジンアガロースを用いて濃縮した。

ウェスタンブロットを行う前に、デスチオビオチン-FPセリンヒドロラーゼプローブも使用し、標識されたタンパク質を濃縮しました。ヒドロラーゼ阻害剤URB597およびCAY10401が脂肪酸アミドヒドロラーゼを阻害（FAAH、図3B）したのに対し、プロテアーゼ阻害剤AEBSFは酵素活性に作用を及ぼしませんでした。阻害剤標的特異性のプロファイリングに加え、活性部位プローブを使用し、阻害剤用量反応曲線（IC₅₀）を用いて薬物結合定数および相対力価を算出することができます。

質量分析法を用いたセリンヒドロラーゼ活性部位の同定

Although assessment of inhibitor targets by fluorescent gel scanning or western blotting are simple methods to evaluate inhibitors, this workflow is limited by SDS-PAGE separation of proteins and the specific antibodies used. A more global approach to inhibitor assessment is required to identify drug targets and off-target effects. The MS workflow can identify protein targets by analyzing enriched proteins or the desthiobiotin-FP-labeled, active-site peptides.

Using the mass spectrometry workflow (Figure 2), we were able to determine active-site labeling sites of over 30 serine hydrolase active-site peptides from mouse brain tissue, including FAAH (Figure 4). We were also able to conclusively map the active-site serine of this enzyme using the electron transfer dissociation (ETD) MS/MS fragmentation technique. Using this approach to generate proteomic target lists, inhibitors can be compared for multiple cell and tissue types.

1. Liu,Y., et al.(1999).Activity-based protein profiling: The serine hydrolases.Proc Natl Acad Sci USA96(26):14694-9.
2. Patricelli, M.P., et al. (2001). Direct visualization of serine hydrolase activities in complex proteomes using fluorescent active site-directed probes. Proteomics1:1067-71. 
3. Okerberg, E.S., et al. (2005). High-resolution functional proteomics by active-site peptide profiling. Proc Natl Acad Sci USA 102(14):4996-5001. 
4. Simon, G.M. and Cravatt, B.F. (2010). Activity-based proteomics of enzyme superfamilies: Serine hydrolases as a case study. JBC285(15):11051-5. 

ActivX FP Serine Hydrolase Probes are exclusively licensed from ActivX Biosciences Inc. to Thermo Fisher Scientific for research use only.