本アプリケーションノートは、Thermo ScientificマイクロプレートルミノメーターとThermo Scientific Pierceルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイをともに使用して、遺伝子研究に強力な組み合わせを高スループットなフォーマットでどのようにして形成するかをご紹介します。本アプリケーションノートの焦点は、異なるルシフェラーゼレポーターアッセイタイプの誘導およびルミノメーターについてです。標準およびシャローウェル384ウェルプレートの小さいアッセイ容積を用いて、どのようにルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイが優れた性能を示すかも説明します。

ルシフェラーゼ遺伝子は遺伝子制御研究でよくレポーター遺伝子として使われます。レポーター遺伝子アッセイは基礎研究で転写調節および細胞シグナル伝達の研究、および創薬でのスクリーニングおよび薬剤ターゲットの検証の両方に使用されます。ルシフェラーゼ反応の発光はレポーター遺伝子アッセイに適したルミノメーターで検出できます。

We have developed a family of luciferase activity assays that use novel luciferase genes from Cypridina and Gaussia combined with the Red Firefly luciferase gene and the green-shifted Renillagene. The assay family provides both flash- and glow-type assays, which differ in the stability of luminescence signals and in sensitivity. Some of the assays utilize luciferases that are secreted into the culture media. This feature allows live monitoring of the reporter activity during cell growth, without a need for cell lysis. In addition, the assay family includes unique dual-spectral luciferase assays for multiplexing purposes. The dual assays include two luciferases: one for measuring the experimental luciferase activity and the other for measuring control activity for normalization. See the luciferase reporter assay portfolio in Figure 1.

図1. Thermo Scientific Pierceルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬およびルシフェラーゼ遺伝子。

グロータイプルシフェラーゼアッセイ

グロータイプルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイはおよそ1時間続く、非常に安定した発光シグナルを発します。発光はゆっくり消滅するので、基質追加後すぐに測定を行う必要はありません。光が安定しているため、アッセイ試薬すべては装置に備わった試薬ディスペンサーを使わずに、ピペットで扱えます。一般的にグロータイプアッセイはフラッシュタイプアッセイより感度が劣ります。

Flash-type luciferase assays

Flash-type luciferase reporter gene assays are in general more sensitive than glow-type assays. Luminescence signals are transient in flash-type assays, so the signal peak is reached soon after assay reagent addition. Therefore, flash-type assays often require the assay reagent to be added with automatic dispensers installed to the luminometer. Reagent dispensers in the instrument facilitate signal monitoring right from the start of the luminescence reaction and enable precise timing between dispensing and measurement from sample to sample. Pipetting the assay reagent manually increases sample-to-sample signal level variations especially in flash-type assays and miss the capture of true flash signal due to delay in measuring the signal after manual reagent addition.

Dual-reporter luciferase assays

Thermo Scientific Luciferase Dual Assays are highly sensitive flash-type assays for multiplexing. The one-step assays are based on having two luciferases emitting luminescent light at spectrally distinct wavelengths. The signals can easily be separated using a luminometer equipped with high transmission filters optimized for the assays. This kind of dual assay eliminates the need for signal quenching between the measurement of two luciferases. Thus both luciferase signals can be detected simultaneously from a single sample with a single reagent addition. As these dual assays are flash-type assays, the reagent dispensers installed to the luminometer act to ensure optimal performance and sensitivity.

Assay Procedures

See the assay procedures of both single and dual luciferase reporter assays in Figures 2 and 3. The protocol of luminescence measurement is very simple: add luciferase samples into a white microplate. In case of a flash-type assay, add the luciferase assay reagent with an automatic dispenser and immediately read the signal for the suggested integration time.

図3. デュアルレポーターアッセイの手順。

ルミノメーター

ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイからの発光は、例えばThermo Scientific Varioskan FlashまたはLuminoskan Ascentマイクロプレートルミノメーターを使用して定量化できます（図4）。Thermo Scientific装置はPierceルシフェラーゼレポーターアッセイと併用することで最高の性能を発揮します。本ルミノメーターはグローおよびフラッシュタイプアッセイの両方の蛍光光度法において高い感度があります。さらに、Varioskan Flashルミノメーターは発光スペクトルおよび蛍光光度法以外の検出も測定できます。

試薬ディスペンサー

Luminoskan AscentおよびVarioskan Flashマイクロプレートルミノメーターは、3つまでの試薬ディスペンサーを備え付けられます（図5）。ディスペンサーは基質添加後すぐに測定が必要で、分注間での正確なタイミングおよびサンプル間や毎日の測定が必要なフラッシュタイプアッセイには欠かせないものです。ルミノメーター付属のディスペンサーは、フラッシュタイプアッセイだけではなくグロータイプアッセイでも反応誘発を簡単、迅速、正確にします。

光学フィルター

さらに、Luminoskan AscentおよびVarioskan Flash装置は両方とも、デュアルルシフェラーゼアッセイ測定のため光学フィルターを装備しています。フィルターは特に2つのルシフェラーゼシグナルをPierceデュアルルシフェラーゼアッセイでできる限り効率的に分離できるように最適化されてあり、そのため優れた性能を発揮することができます。

PierceルシフェラーゼレポーターアッセイおよびVarioskan Flashルミノメーターは、標準384ウェルおよびシャローウェル384ウェルプレートを使用した極めて少量のアッセイ容量でも非常に高い性能で使用可能です。すべてのルシフェラーゼレポーターアッセイは標準およびシャローウェルプレート双方の幅広い濃度範囲に対して、完全な線形応答を示します。現実のアッセイ動態は、ガウシアおよびウミホタルフラッシュアッセイで8桁に及びます（図6）。ウミシイタケフラッシュアッセイも著しく大きいダイナミック測定範囲を示します（データ未掲載）。赤色発光ホタルルシフェラーゼを使用したフラッシュアッセイでは、ある程度ダイナミックレンジが低下して5、6桁になります（データ未掲載）。

Varioskan Flashルミノメーターは自動的に光電子増倍管ゲインを調整し、アッセイのダイナミックレンジを8桁まで増加させます。この独自の特長はルシフェラーゼのサンプルが1億倍の広い濃度範囲にわたって任意のルシフェラーゼ濃度をとる可能性があることを意味しています。したがって、サンプルは追加の希釈ステップを必要とせず測定できます。

図7はガウシア、ウミホタル、ウミシイタケ、ホタルルシフェラーゼのフラッシュタイプ反応速度を示しています。すべてのアッセイで反応開始後2、3秒で発光が最大になります。ウミホタルおよびウミシイタケアッセイはかなり安定した発光を数秒間示し、ガウシアアッセイは最大に達した後、1秒当たり約3%のシグナル減衰を示します。ホタルフラッシュアッセイでは、シグナルが最初の2、3秒間に1秒当たり20%減衰する、最速のフラッシュ反応を示します。

ルミノメーター付属のオートディスペンサーを試薬添加に用いることは、測定の正確なタイミングを確実にするために、特にガウシアとホタルアッセイで強く推奨されます。もし発光反応が手動ピペッティングで開始されると、サンプルが速度反応の異なる時点で測定されることになり、サンプル間のばらつきが増える可能性があります。

アッセイ感度は測定積分時間に依存しますが、その影響は強くはありません。約1秒の測定時間では優れた感度を示しますが、2～3秒の測定時間が最良の感度には必要でしょう。ウミホタルアッセイは最も安定な発光を発し、そのためにシグナルが不安定なアッセイよりもシグナルをある程度長く積分することを推奨します。ホタルフラッシュ反応は最も不安定な動態であり、そのため積分時間は最短にすることを推奨します。使用できる積分時間範囲は、積分時間の変化がアッセイの性能にわずかな影響しか及ぼさない範囲です。シャローウェル384ウェルプレートを少ないアッセイ容量で使用するには、アッセイ容量が多い標準384ウェルプレートより積分時間を長く取ることを推奨します。表1を参照。

表1. 異なるルシフェラーゼアッセイおよびプレートフォーマットの推奨シグナル積分時間（秒）。   Normal
384-well plate Shallow well
384-well plate Luciferase Optimal Usable range Optimal Usable range Gaussia 1.5 1.0 to 1.5 7.0 4.0 to 7.0 Cypridina 5.0 1.0 to 5.0 7.0 3.0 to 7.0 Green Renilla 2.0 1.0 to 2.0 10.0 4.0 to 10.0 Red Firefly 1.0 0.5 to 1.0 1.3 0.5 to 1.3

アプリケーションノートは384ウェルプレートフォーマットで行ったアッセイの結果のみを示していますが、96ウェルプレートフォーマットでの測定でも優れた性能を示します。Luminoskan Ascentルミノメーターとルシフェラーゼレポーターアッセイの性能は、ここに示すVarioskan Flashルミノメーターの結果と同等でした。

• Pierceルシフェラーゼアッセイは、低領域および高領域両方のルシフェラーゼ発現レベルをサンプル濃縮や希釈することなく測定するのに、極めて幅広いダイナミックレンジを持っています。
• The Varioskan Flash multimode microplate reader equipped with a luminometric measurement module detects luciferase activities over a dynamic range of about eight orders of magnitude with the automatic gain adjustment feature of the instrument.
• Using 384-well plates (either normal or shallow well) enables reducing both sample and reagent consumption without sacrificing assay performance. Use of shallow well 384-well plates enables performing the assays in a total volume of about 6µL (1µL sample + 5µL assay reagent).
• Highly sensitive flash-type assays can easily be performed with a microplate luminometer equipped with an automatic dispenser.
• Both inter- and intra-assay variations can easily be minimized using automatic luminometer dispensers, which enable precise timing of the reaction start and signal collection.

Different luciferase reporter gene assays require different features and capabilities of the luminometer. The benefits of using Thermo Scientific luminometers for performing luciferase reporter assays include the following:

• Excellent luminometric performance in glow- and flash-type assays
• Onboard dispensers for reagent addition, which provides precise timing between dispensing and measurement in flash assays, as well as convenience and accuracy for flash and glow assays
• Optimized filters for measurement of dual assays
• Flexible and easy protocol setup and data processing with PC software

ルミノメーター：発光測定モジュールおよびオンボードディスペンサーを備えたThermo Scientific Varioskan Flashマルチモードマイクロプレートリーダーが自動的に試薬を添加

ルシフェラーゼアッセイ試薬：フラッシュタイプのThermo Scientific Pierceルシフェラーゼレポーターアッセイキット、ガウシア（品番16158）、ウミホタル（品番16168）、ウミシイタケ（品番16164）、ホタル（品番16174）ルシフェラーゼ用

Microplates: “Normal” plates were OptiPlate™-384 White Opaque 384-well Microplates (Perkin Elmer, #6007299). “Shallow well” plates were Thermo Scientific Nunc 384-well shallow well standard height white shallow plates (#264706).

Procedure: Luciferase samples from were diluted in the Cell Lysis buffer provided in the kit to create a concentration series of over eight orders of magnitude. Aliquots of 4µL (normal 384-well plate) or 1µL (shallow well 384-well plate) of each dilution were added into the microplate wells. Instrument control software was programmed to add 20µL or 5µL of luciferase assay reagent with a dispenser and to measure the signal kinetically for 15 seconds at a sampling rate of ten readings per second. Each well was dispensed and measured before proceeding to the next well.

Analysis: Luminescence signals were integrated from kinetic curves for different time periods (from 0 to 1 s and from 0 to 15 s). Additionally, individual signals and signal maxima were collected for comparison of different time points. Assay sensitivity and dynamic range were calculated for each data set.

本記事は2012年10月にアプリケーションノートANMRLuci-1012として発表されました。