化学発光ウェスタンブロットはタンパク質研究で一般的なタンパク質検出方法です。化学発光シグナルを測定する一般的なプロトコルではウェスタンブロットをラボグレードのX線フィルムに露光しますが、冷却CCDカメラを使用するデジタルイメージングは研究者にとってさらに機能的な選択となってきています。Thermo Scientific myECL Imagerでは、シグナル感度、直線性、ダイナミックレンジの向上など、フィルム検出にいくつかの改良を加えたデジタルイメージングが可能になります。

ウェスタンブロット解析は、ターゲット特異的抗体を用いて、サンプル中の特定の目的タンパク質を定性的評価するために使用されます。タンパク質の相対量は、シグナル強度で評価することができます。これは、一般的にシグナル強度がブロット中のタンパク質の量に相関するためです。フィルムを汎用スキャナーでスキャンして画像分析ソフトウェアを使用することが、定量的情報を取り出す方法として使用されてきました。しかし、スキャンしたX線フィルムからの画像デンシトメトリーは困難なことがあり（文献1）、化学発光ウェスタンブロット解析は一般的に定量的ではないとみなされています。

ウェスタンブロットからの発光シグナルを捕捉するX線フィルムの代替法としては、冷却CCDカメラがあります。電荷結合素子（CCD）カメラは、光子をデジタル信号に変換する感光性シリコンチップを使用します。暗所で使用する用途向けに設計されたCCDカメラが付属した初期のイメージャーは、X線フィルムの速度や感度に対抗できませんでした。

Recent improvements in CCD technology have enabled the development and commercialization of sensitive, cooled-CCD cameras with higher light-capturing performance than film. High-performance CCD cameras cool the silicon chip to sub-zero temperatures to reduce dark current, which produces background noise. To enhance detection sensitivity further, the pixels, or light capturing units of the CCD chip, can be combined or binned. Binning increases the size of each pixel, which effectively increases the amount of light collected in the pixel area.

図1. ビニングが感度を向上させる仕組み

高感度CCDカメラおよびデジタル画像分析ソフトウェアを組み合わせると、化学発光ウェスタンブロット解析を行う研究者は、かつてフィルムで行った以上の正確な定性および定量情報を得ることができます。本記事では、myECL ImagerがX線フィルムに比較して感度、ダイナミックレンジ、シグナルの直線性で優れていることを示します。

CCDカメラとX線フィルムイメージングを比較するため、NIST（アメリカ国立標準技術研究所）-トレーサブルなルミノメーターリファレンスプレート（Harta Instruments、番号RM-168）と、イメージャーおよびフィルムの検出可能範囲で連続希釈したサンプルの化学発光ウェスタンブロットを用いて評価しました。シグナルをmyECL Imagerを使用してデジタルに取り込み、X線フィルムで露光しました（画像解析のため、現像済みフィルムを高解像度でスキャンしてデジタル版を作成）。最後に画像をThermo Scientific myImageAnalysisソフトウェアで解析しました。

X線フィルムと比較して高い感度・広いダイナミックレンジ

Images acquired on the myECL Imager are more sensitive than film. Seven of the eight reference plate spots are visible and distinguishable above background on the 300-second exposure acquired by the myECL Imager (Figure 2). In contrast, only five of the eight spots are visible on a 300-second exposure to film. Densitometry of these images shows a 1000-fold dynamic range (maximal signal intensity/minimal signal intensity) in the myECL Imager compared to a 1.5-fold dynamic range for the film, where dynamic range is calculated from the density of spot 1 divided by the density of spot 8 (Figure 2; Table 1). A qualitative assessment of the western blot examples shows that the myECL Imager detects an additional band of the HeLa lysate dilution series when compared to film (Figure 3).

表1. レファレンスプレートを300秒間露光した際のデンシトメトリー値。結果は、myECL Imagerのダイナミックレンジが1000倍（45017/45）、X線フィルムのダイナミックレンジが1.5倍（62734/41286）となりました。 Luminometer Reference Microplate Density (Intensity/Area) Spot # Relative Light Units myECL Imager X-ray Film 1 2325926 45017 62734 2 1378005 44960 62517 3 279943 36210 61699 4 28595 18483 52635 5 7239 4684 45643 6 1478 919 42289 7 169 125 41545 8 17 45 41286

シグナルの直線性

シグナルの直線性は定量測定には重要な因子です。シグナル強度とサンプル量の関係が直線的であれば、未知サンプル量は簡単な線形回帰モデルを使用して計算できます。目視では、X線フィルムへの露光は広い範囲でシグナルの直線性があるように見えるかもしれません。しかし、デンシトメトリーによるとフィルム上のシグナルは狭い線形ダイナミックレンジであることが示されています。myECL ImagerとX線フィルムとでは、シグナル直線性に差があります（図4）。myECL ImagerではGFP-HAのシグナルが1 ngまで直線的に増加しましたが、フィルムでは直線的なシグナル増加は0.125 ngまでしかありませんでした。シグナルが飽和に達したのはフィルムではGFP-HA 0.125 ngであったのに対し、myECL Imagerでは2 ngでした。

myECL Imagerにおける高ピクセルビニングで画像感度が向上

ピクセルビニングは隣接するピクセルのシグナルを結合し、CCDチップの光捕捉能力（感度）を向上させる機能です。一方で、ピクセル結合によりピクセルが大きくなると、取り込んだ画像の解像度が低下することになります。

Each binning increase results in an increase in light capturing ability or sensitivity (Figure 5). Adjustment of the binning setting allows the researcher to find the desired balance between sensitivity, resolution and exposure time. We found the default 3 × 3 setting generally offers the best combination of sensitivity and resolution when using the myECL Imager.

ライフサイエンス分野の研究者は従来からX線フィルムをウェスタンブロット解析に使用してきました。フィルムはタンパク質検出の定性的データを提供しますが、ダイナミックレンジが狭く感度も低いため、タンパク質定量に用いるには限界があります。有害な現像液の取り扱い、現像機の保守、暗室の必要性などフィルムには他の欠点もあり、デジタルイメージングの方が簡単でより実用的になっています。myECL Imagerは広く直線的なダイナミックレンジを持ち、研究者がウェスタンブロットから定量データを取り出すことが可能で、さらに利便性と感度という利点があります。

ルミノメーターレファレンスプレートの経時変化

ルミノメーターレファレンスプレート（Harta Instruments、番号RM-168）を使用し、myECL Imagerおよび標準X線フィルム（Thermo Scientific CL-XPosure Film、品番34090）のイメージング速度および感度を比較して示しました。レファレンスプレートには異なる既知のシグナル強度を持つ8個の光（スポット）が含まれ、一般的にルミノメーターのキャリブレーションに用いられています。画像はフィルムおよびmyECL Imagerで10、30、60、120、300秒間露光しました。myECL Imagerでは5個すべてのビニング設定（1 × 1、2 × 2、3 × 3、4 × 4、8 × 8）を使用しました。フィルムはKonica Minolta™ SRX-101A Film Processorで、現像試薬で現像しました。分析に用いるフィルムのデジタル画像を作成するには、各フィルムをmyECL Imagerからの画像出力と一致させるため、Epson™ 4990 Photo Scannerで300 PPI（ピクセル/インチ）、16ビットグレースケールTIFF画像としてスキャンしました。画像分析はThermo Scientific myImageAnalysisソフトウェアで行いました。分析では等サイズの対象領域をレファレンスプレート中の8個の各スポットに対して設定し、メーカーの分析証明書に従って、密度（ピクセル強度/領域面積）を測定したRLU（相対発光量）に対しプロットしました。本掲載用に、myECL Imagerで得られた低強度ピクセルにより画像のホワイトレベルコントラストを調整しました。

Western blots

Fifty micrograms of HeLa lysate was serially diluted (2-fold in each lane) in 4X LDS Sample Buffer (Product # 84788) supplemented with DTT at a final concentration of 50mM. The amount of sample loaded onto the gel was 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.781, 0.391, 0.195 and 0.0977µg of lysate. Samples were loaded onto 4-20% Thermo Scientific Precise Tris-Glycine Gels (Part No. 25249) and transferred to Thermo Scientific PVDF Transfer Membrane (Part No.88518) using the Thermo Scientific Pierce G2 Fast Blotter (Part No. 62288) and 1-Step Transfer Buffer (Part No.84731). The blots were probed with mouse anti-PLK1 (Ab No. MA1-848) or rabbit anti-Cyclophilin B (Ab No. PA1-027A) according to instructions supplied with the Thermo Scientific Fast Western, SuperSignal West Dura Kit (Part No. 35070) for 1 hour. The anti-mouse or anti-rabbit fast western optimized horseradish peroxidase (HRP) reagents were added for 10 minutes, followed by four 5-minute washes with Thermo Scientific Fast Western Wash Buffer. SuperSignal West Dura Substrate was added for 5 minutes before imaging on film, followed by image capture using the myECL Imager. Signal loss between imaging events (approx. 5 minutes) was negligible (data not shown). Images were acquired on the myECL Imager in Chemi mode with the default binning setting (3 × 3). X-ray film was developed and scanned as described above.

In vitro protein expression

The Thermo Scientific 1-Step Human In Vitro Protein Expression Kit (Part No. 88882) was used to express green fluorescent protein (GFP) with a C-terminal HA tag. XhoI and NdeI restriction sites were added to the 5’ and 3’ ends, respectively, to the open reading frame of GFP from Pontellina plumata. This fragment was inserted into the multiple cloning site of the pT7CFE-CHA expression vector, which contains the upstream transcription and expression elements necessary for in vitro translation and a C-terminal HA (Human Influenza Hemagglutinin-YPYDVPDYA) tag. Protein expression was performed as described in the kit protocol. After protein expression, the concentration of GFP was determined by measuring fluorescence (482ex/502em) in a Safire™ Microplate Reader and compared to a GFP standard.

Signal linearity

A serial dilution of 2.0 to 0.004ng of in vitro-expressed GFP was loaded onto 4-20% Precise Tris-Glycine Gels and transferred to nitrocellulose membrane using the Pierce G2 Fast Blotter and 1-Step Transfer Buffer. The blot was probed with Thermo Scientific Mouse anti-HA Antibody (Part No. 26183) according to instructions supplied with the Fast Western, SuperSignal West Dura Blot Kit for 1 hour. The anti-mouse fast Western optimized HRP reagent was added for 10 minutes, followed by four 5-minute washes with Fast Western Wash Buffer. SuperSignal West Dura Substrate was added for 5 minutes before imaging on film, followed by the myECL Imager. Signal loss between imaging events (approx. 5 minutes) was negligible (data not shown). For analysis, a manual region of equal size was used over each of the GFP-HA bands in all 10 lanes plus a representative background region. The Global Background Subtracted Density (pixel intensity/region area) was plotted against nanograms of GFP-HA. For publication, the white-level contrast was adjusted on the images acquired with the myECL Imager to display low-intensity pixels.

1. Gassmann, M., Granacher, B., Rohde, B. and Vogel, J. (2009) Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.Electrophoresis 30:1845-55.

本記事は2013年4月にアプリケーションノート1602635として発表されました。