Cell Imaging Support—トラブルシューティング

こちらが確認できるページです。「Cell Imaging Systems」セクションの下を探して、EVOS™Imaging Systemのリンクに従います。そこには、無料のダウンロードリンクと手順が記載されています。少なくとも6か月ごとに更新を確認することをお勧めします。または、お使いのシステムに何らかのソフトウェアの不具合があるように思われる場合は、更新を確認することをお勧めします。

対物レンズは、フォーカスがZ軸の高すぎる場合（上下）にベッセルホルダーに当たる可能性があります。 これは、EVOS™FL Auto Imaging Systemのスタートアップ時やシステムの起動時にステージが移動する時、対物レンズを交換する時などに特に問題となります。カバースリップ補正の対物レンズは、バレルの上部で広く平坦になる傾向があります。特にサンプル容器の端でイメージングを行う場合、ベッセルホルダーの端にぶつかる可能性が高くなります。そのような場合、コンテナのこれらの領域にその対物レンズを使用できない可能性があります。対物レンズがベッセルホルダーに「詰まっている」場合は、ベッセルホルダーの蝶ネジを慎重に緩めてステージからまっすぐに持ち上げ、対物レンズを焦点を合わせて下向きにステージの中央に移動します。その日の装置の電源を切る前に、対物レンズを最低倍率に移動し、下向きに焦点を合わせるなど、研究室でのシャットダウン手順を決めておくことお勧めします。

ベッセルホルダーにこすりつけると、対物レンズが損傷する可能性があります。このような場合は、対物レンズを取り出し、特にレンズに損傷がないか注意深く調べます。 

EVOS™ Imaging Systemの場合：

• ライトが点灯していることを確認します（簡単なテスト方法：薄い紙をステージに置く）。 
• サンプルが不透明すぎないことを確認します。キャリブレーションスライド、またはスライド上の別の薄い、または単一細胞のサンプルと比較します。
• 対物レンズをチェックして、タレットの位置が合っており、対物レンズがスロットに完全にセットされていることを確認します。
• EVOS™FL Imaging Systemの場合：ライトキューブの位置を変更します。
• EVOS™FL Auto Imaging Systemの場合：スコープからコンピューターに接続されているすべてのUSBポートが挿入されていることを確認します。
•  明視野設定では、コンデンサスライダースロットを確認します。コンデンサスライダーが正しく所定の位置にあることを確認します。

まず、すべてのフィルターセットの下で未染色/非標識組織を調べて、これが内因性自己蛍光に起因していないか確認します。このことは、特にパラフィン切片で問題になります。コントロールで自己蛍光が見られる場合は、ブロッキングと標識の前に1 mg/mLの水素化ホウ素ナトリウムで3 x 10分間洗浄することで低減できます。

色素電荷による二次抗体の非特異的結合が起こっている可能性があります。たとえば、負電荷の色素は正電荷の細胞成分に引き寄せられます。Image-it™FX Signal Enhancer（カタログ番号I36933およびR37107）を使用すると、標識の色素と細胞成分との電荷相互作用による非特異的結合をブロックできます。

いくつかの抗体を含む一部の標識は十分な親和性が低く、標識スライドの保存中に時間の経過とともに剥離する可能性があります。二次抗体反応の後5～15分間ホルムアルデヒドでサンプルを固定すると、二次抗体を所定の位置に架橋できるため、この剥離を遅くできます。また、サンプルは、ProLong™Diamond Antifade Mountantなどの硬化封入剤に封入する必要があります。この 硬化封入剤は二次抗体の拡散を遅くします。封入剤が完全に硬化した後、スライドを低温（できれば-20^°C）で保管すると解離をさらに遅らせることができます。

細胞や組織をキシレンやアセトンなどの溶媒で処理すると（組織切片の脱パラフィン処理など）、ファロイジンの結合を防ぐようにF-actinに影響を与えます。ファロイジンは、通常有機溶媒で洗浄されない凍結切片に使用したり、抗アクチン抗体を使用できます。

すべての蛍光色素は、吸収した波長で強い光にさらされると、少なくともある程度は退色、すなわち「光退色」します。光退色の原因と問題を解決する方法は次のとおりです。

こちらから 、褪色防止用試薬を選択するための良いガイドをご確認ください。

まず、適切な波長の色素を励起し、検出していることを確認します。次に、コントロールで色素の濃度と染色時間を最適化してください。当社のマニュアルにはいくつかのガイドラインがあります。生細胞システムを使用している場合は、バックグラウンド蛍光を低減させるために、未反応色素を洗い流すことや、Backdrop™Suppressor ReadyProbes™Reagentなどのバックグラウンド抑制剤を添加することを推奨します。機器の設定を確認してください。たとえば、一部のプレートリーダーには、最適なシグナル/バックグラウンドを得るためにゲイン設定を調整する手段があります。最後に、一部の色素はイオン検出時の変化度において他の色素よりも優れています。色素のオプションについてご希望の場合は、テクニカルサポートtechsupport@thermofisher.comにメールでお問い合わせください。

気泡は、次の2つのいずれかの方法で除去できます。

1. サンプルに使用するProLong™褪色防止剤/封入剤の混合物液（必要量より少し多めに）を微量遠心チューブに入れます。キャップを閉め、卓上微量遠心分離機を使用して遠心分離します（速度7,000～13,000 rpm）。気泡は、上部に移動するため、ピペッター/ピペットチップを使用して吸引できます。
2. ProLong™褪色防止剤/封入剤混合物が入ったボトル/バイアルの蓋を緩めてます（蓋は取り外さないでください）。蛇口吸引器（蛇口Tチューブ）を使用して、ボトル/バイアル全体を真空フラスコに入れます。バキューム（蛇口を通る水）をかけ、10分から20分まで吸引して、混合物を脱気します。

サンプル上の気泡の形成を防ぐ、または気泡の除去する：

1. 封入に必要な量のProLong™褪色防止剤／取り付け媒体の混合物をピペッティングする前に、ピペッターをわずかに過剰な量に設定してください。混合物をピペッティングするときは、全量を分注するのではなく、全量に達していない状態で、ボトルからチップを引き上げてください。これにより気泡がピペットチップに吸引されるのを防ぎます。
2. カバーガラスの貼り付け中に気泡が閉じ込められる：カバーガラスをProLong™褪色防止試薬／封入剤の混合物の滴に置く際、始めは少し斜めに置き、その後静かにカバーガラスを下げます。カバーガラスをサンプル上で平らに下げたる、または速く下げすぎると、気泡が閉じ込められます。
3. 組織内に閉じ込められた気泡：組織切片、特に凍結切片の問題の1つは、切片の内部および下に空気が閉じ込められる可能性があることです。封入時に気泡は観察されませんが、封入剤が硬化するとサンプルがわずかに圧縮され、切片から空気が排出されます。これにより、封入剤内に閉じ込められた切片上に微細な気泡が形成されます。回避するには、封入前に組織サンプルを脱気してください。バッファーまたはブロッキング溶液に浸した切片を真空チャンバーに入れ、サンプルを真空にさらします。これにより、切片とバッファーが脱気されます。この脱気したバッファーからサンプルを取り出し、封入します。
4. ProLong™褪色防止試薬で封入し、硬化したサンプルに気泡がある場合は、スライドをPBS（PBSで満たされたコプリン瓶またはペトリディッシュ）に入れることでサンプルを再度封入できるようになります。ProLong™褪色防止試薬は膨張し、カバースリップはスライドしてスライドするか、手動でゆっくりと取り外すことができます。その後、ProLong™褪色防止試薬／封入液混合物の新しい液で再度封入できます。