Donkey anti-Mouse IgG 2차

Thermo Fisher Scientific은 항체 성능 및 특이성 테스트 분야에 많은 노력을 기울이고 있습니다. 이러한 노력의 일환으로 웨스턴 블로팅 애플리케이션 용도의 각 Invitrogen 항체를 아래 제시된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 테스트하였습니다. 이 테스트는 항체 성능을 확인하고 실험에서 탁월한 결과를 보장하는 데 도움이 됩니다.

Invitrogen 항체에 적용되는 일반적인 웨스턴 블랏 프로토콜은 아래와 같습니다.

참고: 이 프로토콜의 일부 단계는 사용되는 시료와 항체에 따라 최적화가 필요합니다.

시료 전처리

  1. 100oC에서 10분 동안 끓여 용해(lysis) 버퍼와 LDS 시료 버퍼(환원제와 포함 혹은 불포함)에서 원하는 농도로 로드할 시료를 준비합니다.

참고: 일반적으로 단백질 양, 분자량 및 사용되는 젤 유형에 따라 웰당 10–50 µg의 단백질이 로드됩니다.

  1. 시료를 냉각시키고 간단하게 회전시켜 침전물을 수집합니다. 

SDS-PAGE

  1. SDS-PAGE 젤 시스템을 조립하고 SDS PAGE 러닝(running) 버퍼를 채웁니다.
  2. 젤에서 콤(comb)을 제거합니다. 웰에 기포 또는 잔류 폴리아크릴아미드가 없는지 확인합니다.
  3. 시료와 적절한 분자량 마커를 로드합니다.

참고: 분자량(MW) 마커는 검출 단계 후 MW가 정확하게 추정될 수 있도록 예상 MW 범위를 모두 포함해야 합니다.

  1. 최대 150 볼트의 SDS-PAGE 젤 시스템(예: XCell SureLock 장치)에서 젤을 실행(run) 합니다. 러닝(running) 버퍼가 누출되지 않도록 하고 젤이 녹지 않도록 시스템이 차가운 상태로 유지되는지 확인합니다.
  2. 로딩 염료 전면과 염색된 분자량 마커를 관찰하여 젤 실행(run) 시간을 결정합니다. 

트랜스퍼  

습식 트랜스퍼(고분자량 및 저존재비 단백질에 대해 권장)

  1. 모든 스폰지와 필터 페이퍼를 트랜스퍼 버퍼에 담가 트랜스퍼 장치를 준비합니다.
  2. SDS-PAGE 젤 시스템에서 젤을 제거하고 탈이온수로 헹군 다음 트랜스퍼 버퍼로 평형화합니다.
  3. 블랏 모듈(즉, XCell II Blot Module)에서 트랜스퍼 스택을 준비합니다. 스택에는 다음이 포함됩니다(캐소드에서 애노드까지). 흡수 스폰지 3개, 필터 페이퍼, 젤, 멤브레인, 필터 페이퍼, 흡수 스폰지 3개

참고: 젤 위에 멤브레인을 놓을 때 모든 기포를 제거해야 합니다.

  1. 블랏 모듈을 XCell SureLock Mini-Cell에 놓고 웨지를 배치합니다.
  2. 코어를 트랜스퍼 버퍼로 완전히 채우고 외부 챔버를 탈이온수로 완전히 채웁니다.
  3. 냉장실에서 80 볼트 조건하에서 2-3시간 동안 또는 25 볼트 조건 하에서 밤새 실행(run) 합니다.

참고: 단백질 트랜스퍼 시간은 단백질의 분자량에 따라 달라집니다.

iBlot 트랜스퍼 시스템을 이용한 드라이 트랜스퍼(단백질이 <100 kDa인 경우 권장)

  1. 래치를 사용하여 iBlot 3 Western Blot Transfer System의 뚜껑을 엽니다. 블로팅 표면이 깨끗한지 확인합니다.
  2. iBlot 3 트랜스퍼 스택을 개봉하고 상단 스택을 분리한 다음 트랜스퍼 젤 층이 위를 향하도록 측면에 설치합니다. 하단 스택은 투명한 플라스틱 트레이에 유지합니다.
  3. 상단 스택에서 흰색 분리막(separator)를 제거하고 하단 스택을 트레이와 함께 블로팅 표면에 직접 배치합니다.
  4. 사용되는 iBlot 3 트랜스퍼 스택의 유형에 따라 블로팅 표면 상에 트레이를 정렬합니다.

참고: 트레이의 전기 접점이 iBlot 3 웨스턴 블랏 트랜스퍼 장치의 블로팅 표면에 있는 해당 전기 접점과 정렬되어야 합니다.

  1. 젤 카세트를 열고 프리-런(pre-run) 젤을 탈이온수에 잠시 담근 다음 하단 스택의 트랜스퍼 멤브레인 위에 젤을 놓습니다. 블로팅 롤러를 사용하여 기포를 제거합니다.
  2. iBlot 3 필터 페이퍼를 탈이온수에 담가 적신 후, 젤 위에 미리 적신 이 필터 페이퍼를 놓습니다. 기포가 모두 제거되었는지 확인합니다.
  3. 구리 전극이 위를 향하도록 필터 페이퍼와 젤 위에 상단 스택을 놓습니다. 기포를 모두 제거합니다.
  4. iBlot 3 웨스턴 블로팅 트랜스퍼 장치 뚜껑을 닫고 적절한 트랜스퍼 프로그램을 선택합니다. 
  5. 트랜스퍼가 완료되면 트랜스퍼 멤브레인을 제거하고 블로킹(blocking) 또는 염색(staining) 절차를 진행합니다.

세미-드라이 트랜스퍼

  1. 얕은 트레이에서 2.5 mm 두께의 블로팅 필터 페이퍼 2개를 트랜스퍼 버퍼에 잠시 담급니다.
  2. 버퍼에 잠긴 상태에서 스택 위를 블로팅 롤러로 굴리면서 필터 페이퍼 사이에 갇힌 기포를 제거합니다.
  3. 미리 적신 필터 페이퍼 스택을 세미-드라이 블로터의 애노드 플레이트에 놓습니다. 기포를 모두 제거합니다.
  4. 필터 페이퍼 위에 미리 적신 블로팅 멤브레인을 놓고 기포를 제거합니다.
  5. 젤 카세트에서 젤을 조심스럽게 제거하고 트랜스퍼 버퍼에 담급니다.
  6. 블로팅 멤브레인 위에 젤을 놓습니다.
  7. 나머지 필터 페이퍼를 간단히 적신 후 젤 위에 적층시킵니다. 필터 페이퍼 시트가 올바르게 정렬되어 있는지 확인하고 젤/멤브레인 샌드위치와 함께 플러쉬(flush) 합니다. 기포를 모두 제거합니다.
  8. 캐소드 플레이트 뚜껑을 스택 위에 놓고 손잡이를 조입니다.
  9. 20 볼트 조건하에서 30–60분간 실행(run) 합니다.

멤브레인 염색(옵션)

균일한 트랜스퍼를 제어하기 위해, 다음 절차에 따라 멤브레인을 ponceau-S로 염색할 수 있습니다.

  1. 1X PBST(PBS-Tween 20)로 멤브레인을 간단하게 세척하고 멤브레인에 ponceau-S 염색(stain) 용액을 첨가하여 염색합니다. 멤브레인을 젤 로커(rocker)에서 2분간 유지합니다.
  2. 1X PBST로 3–4회 멤브레인을 세척하여 과도한 염색(stain)을 씻어냅니다.

블로킹(blocking)

특정 워크플로우에 사용할 블로킹 버퍼를 선택합니다. 항체 농도 또는 검출 기질과 마찬가지로, 블로킹 버퍼의 선택은 좋은 결과를 얻기 위해 중요하며 블로킹을 최적화해야 합니다. 아래 제안된 용액 외에도 다양한 종류의 바로 사용 가능한(ready-to-use) 블로커를 사용할 수 있습니다.

  1. 실온의 젤 로커(rocker) 상에서 1X PBST 또는 TBST(TBS-Tween 20)로 희석된 5% 탈지우유 또는 5% BSA를 사용하여 1시간 동안 멤브레인을 블로킹합니다.

참고: 인산화된 표적의 경우 5% BSA로 블로킹하는 것이 좋습니다.

1차 및 2차 항체를 사용한 프로빙(probing)  

HRP 콘주게이트

  1. 젤 로커(rocker) 상에서 4oC로 밤새 또는 실온으로 2-3시간 동안 블로킹 버퍼로 전처리한 1차 항체의 적절한 희석액과 함께 멤브레인을 인큐베이션합니다.

참고: 1차 및 2차 항체의 양은 사용되는 항체와 실행(running)하는 시료에 따라 다릅니다. 양호한 시작점은 항체 제품 페이지에서 권장 희석 범위를 확인하고 거기에서 실험을 위한 최적의 항체 희석을 찾기 위해 적정하는 것입니다.

  1. 인큐베이션 후 멤브레인을 5분 동안 1X PBST 또는 TBST로 3회 세척합니다.
  2. 젤 로커(rocker) 상 실온 조건하에서 블로킹 버퍼로 전처리한 HRP 콘주게이트 2차 항체의 권장된 희석액과 함께 멤브레인을 30-45분 동안 인큐베이션합니다.
  3. 2차 항체를 제거하고 젤 로커 상에서 각각 5분 동안 1X PBST 또는 TBST로 멤브레인을 3회 세척합니다.
     

형광 콘주게이트

참고: 형광 아티팩트가 될 수 있는 응집물이 멤브레인에 발생하지 않도록 형광 웨스턴 블랏용 버퍼를 여과멸균하는 것이 좋습니다. 

  1. 젤 로커(rocker) 상에서 4°C로 하룻밤 또는 실온으로 2-3시간 동안 블로킹 버퍼로 전처리한 1차 항체의 적절한 희석액과 함께 멤브레인을 인큐베이션합니다.

참고: 멀티플렉스 분석의 경우, 교차 반응을 방지하기 위해 다른 종의 1차 항체를 사용하십시오.

참고: 1차 및 2차 항체의 양은 사용되는 항체와 실행하는 시료에 따라 다릅니다. 양호한 시작점은 항체 제품 페이지에서 권장 희석 범위를 확인하고 거기에서 실험을 위한 최적의 항체 희석을 찾기 위해 적정하는 것입니다.

  1. 인큐베이션 후 멤브레인을 5분 동안 1X PBST 또는 TBST로 3회 세척합니다.
  2. 젤 로커(rocker) 상 실온에서 블로킹 버퍼로 전처리한 형광 콘주게이트 2차 항체의 권장 희석액과 함께 멤브레인을 30-45분 동안 인큐베이션합니다. 블랏 컨테이너를 알루미늄 호일로 덮어 형광단을 빛으로부터 보호합니다.

참고: 멀티플렉스 분석의 경우, 교차 반응 가능성을 줄이기 위해 교차 흡수 2차 항체를 사용하십시오. 또한, 교차 채널 블리드(bleed)를 방지하기 위해 뚜렷이 구별되는 형광단을 선택하십시오.

  1. 2차 항체를 제거하고 젤 로커(rocker) 상에서 각각 5분 동안 1X PBST 또는 TBST로 멤브레인을 3회 세척합니다.

블랏 현상  

HRP 웨스턴 블로팅

  1. 2-5분 동안 ECL 화학 발광 기질을 사용하여 블랏을 현상합니다. 멤브레인을 투명 필름에 놓고 과도한 기질을 제거합니다.

참고: 노출 시간이 수 분 이상인 경우 SuperSignal West Pico, SuperSignal West Dura 또는 SuperSignal West Femto와 같이 감도가 더 높은 기질을 사용하는 것이 좋습니다.

  1.  iBright 이미징 시스템과 같은 화학 발광 이미저를 사용하여 이미지를 획득합니다.  

형광 웨스턴 블로팅

  1. 형광 이미저를 사용하여 이미지를 획득합니다.
  2. 사용 전에 70% 알코올로 이미징 표면을 꼼꼼하게 세척합니다.
  3. 블랏을 이미징 표면에 놓고 기포 없이 평평하게 놓여 있는지 확인합니다.
  4. 멀티플렉스 분석의 경우, 800 nm 채널을 사용하여 존재비가 낮은 단백질 또는 약한 표적을 검출할 수 있습니다. 680 nm 채널을 사용하면 존재비가 높은 단백질 또는 강한 표적을 검출할 수 있습니다.

최종 데이터 출력의 예

WB의 Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody . K-562(Lane 1) 및 U-87 MG(Lane 2)의 전체 세포 추출물(30 µg 용해물)에서 웨스턴 블로팅 분석을 수행했습니다. 이 블랏은 Anti-SOD2 Mouse 단클론 항체로 프로빙되었고 Donkey anti-Mouse IgG 2차 항체, Alexa Fluor 790을 사용하여 희석액 0.2 µg/mL (그림 1), 0.1 µg/mL (그림 2) 및 0.04 µg/mL (그림 3)에서 검출되었습니다. SOD2에 해당하는 22 kDa 밴드가 관찰되었습니다. Novex NuPAGE 12% Bis-Tris 젤, XCell SureLock 전기영동 시스템 및 Novex Sharp Pre-Stained Protein Standard을 사용하여 알려진 양의 단백질 시료를 전기영동했습니다.  그런 다음 분해된 단백질을 iBlot 2 Dry Blotting System을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼했습니다. 5% 탈지우유로 멤브레인을 블로킹한 후 관련 1차 및 2차 항체로 멤브레인을 프로빙했습니다. Odyssey Fc 이미징 시스템(Li-cor Biosciences)을 사용하여 형광 검출을 수행했습니다.

리소스

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.