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저존재비 타겟을 위한 티라미드 신호 증폭
Invitrogen SuperBoost 티라미드 신호 증폭 키트 및 시약은 예외적인 신호 증폭을 위해 특별히 설계되어 저존재비 타겟의 이미징에 필요한 추가적인 신호 정의 및 선명도를 제공합니다. Invitrogen Alexa Fluor 염료의 밝기와 폴리-HRP 매개 티라미드 신호 증폭을 결합한 SuperBoost 시약은 표준 처리 및 기타 티라미드 신호 증폭 시약보다 일반적으로 2 ~ 10배 높은 감도를 생성합니다. 이 제품은 면역조직화학, FISH 및 기타 다중화 면역 표현형 분석 방법에 특히 유용합니다.
티라미드 신호 증폭은 어떤 원리로 작동합니까?
티라미드 신호 증폭 과정에는 1차 항체와 결합한 단백질 epitope 주변의 티로신 잔류물과 결합하도록 형광단 티라미드를 효소적으로 전환시키는 HRP(Horseradish peroxidase)의 사용이 포함됩니다. 제어된 효소 반응으로서 티라미드 신호 증폭은 효소 활성 부위에서 확산되지 않으므로 HRP 또는 알칼리성 인산가수분해효소 기반 방법에 비해 더 나은 공간 분해능을 제공합니다.
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그림 1. SuperBoost 티라미드 신호 증폭 시스템의 그림. 항원은 1차 항체(파란색)에 의해 검출된 다음 폴리-호스래디쉬과산화효소(poly-HRP) 접합 2차 항체(노란색)에 의해 검출됩니다. HRP에 의해 염료 라벨링된 티라미드(녹색)의 활성화는 활성화된 티라미드 유도체(분홍색)의 국소 침착을 유발합니다.
SuperBoost 티라미드 신호 증폭이란 무엇입니까?
IHC, 공간 단백질체학 (spatial proteomics) 및 기타 복합 분석 이미징 실험의 경우 비특이적 결합에 대한 저존재비 단백질 및 자가형광물질을 검출하는 제한이 있습니다. SuperBoost 티라미드 키트 및 시약은 증폭 방법으로 폴리-HRP 접합 2차 항체를 사용합니다. 다수의 HRP를 가진 항체는 조직 침투력을 잃지 않으면서 신호를 개선합니다.
이점은 아래와 같습니다.
- 존재비가 낮고 검출이 어려운 표적을 위한 고감도 형광 이미징 검출 방법
- 표준 필터 및 현미경과 호환되는 신호를 생성하는 사용이 간편한 키트
- 고해상도 이미지 및 형광 단백질, DAPI, 2차 항체 및 기타 SuperBoost 키트와의 복합 분석 호환성
그림 2. 폴리-HRP가 포함된 SuperBoost 티라미드 키트 및 시약은 더 긴 시간 동안 더 밝은 신호를 생성합니다. HeLa 세포를 다양한 농도의 항프로히비틴 항체(제조업체는 1:150 희석 또는 최종 5 μg/mL 권장)와 함께 배양한 다음 (1) Invitrogen Alexa Fluor 488 티라미드 SuperBoost 키트(염소 항-토끼 IgG 및 Alexa Fluor 488 티라미드), (2) 당사의 오리지널 Invitrogen TSA 키트 #12(염소 항-토끼 IgG 및 Alexa Fluor 488 티라미드) 또는 (3) Invitrogen F(ab′)2 rabbit anti–goat IgG (H+L) secondary antibody의 시약으로 라벨링했습니다. Invitrogen EVOS FL 자동 이미징 시스템(EVOS 이미징 시스템 정보 참조)을 사용하여 각 처리별로 세포 이미지를 캡처했습니다(동일한 노출 및 게인 사용). 이들 이미지는 Alexa Fluor 488 티라미드 SuperBoost 키트가 당사의 오리지널 TSA 키트 또는 직접 라벨링된 2차 항체보다 더 높은 감도의 검출 성능을 제공하는 것을 보여줍니다.
SuperBoost 티라미드 신호 증폭 사용 방법
SuperBoost 티라미드 신호 키트는 사용이 간단하며 단독으로 또는 다른 시약 및 형광단과 통합할 수 있습니다. 이 워크플로우에서 형광단 접합 2차 항체는 폴리-HRP와 결합된 2차 항체를 포함하는 SuperBoost 티라미드 신호 증폭으로 대체됩니다. 유일한 추가 단계는 2-10분 동안 접합 티라미드와 함께 배양하고 특정 신호가 감지되면 HRP 활성을 중지하기 위한 정지 용액을 추가하는 것입니다. 정지 용액은 형광 신호의 특이성과 분해능을 유지하는 데 도움을 줍니다. SuperBoost 티라미드 신호 증폭 키트는 표준 ICC, IHC 및 FISH에 사용되는 제품과 동일한 간단한 워크플로우를 제공합니다.
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그림 3. SuperBoost 티라미드 신호 키트 워크플로우. 이 워크플로우는 선명하고 밝은 신호를 제공하도록 최적화할 수 있는 6단계 또는 7단계 프로세스입니다. 이 워크플로우는 다른 형광 시약 및 2차 항체 형광단을 추가할 단계를 알려줍니다.
단백질 발현 검출은 1차 클론 및 2차 검출 방법에 따라 달라집니다. 저존재비 단백질을 식별하는 신호를 증폭하려면 SuperBoost 티라미드 신호를 사용해야 합니다. 당사는 다양한 단백질 존재비를 검출하는데 도움이 되는 다양한 검출 기술을 제공합니다.
- 높은 존재비 표적 - 1차 콘주게이트, 증폭 불필요
- 중간 존재비 표적 - 2차 콘주게이트, 보통 수준 증폭
- 중간-낮은 존재비 표적 – 스트렙타비딘(streptavidin) 콘주게이트, 상당한 수준의 신호 증강
- 낮은 존재비 표적 - 신호 증강 극대화를 위한 효소 증폭
적절한 검출 기술을 선택하려면 면역형광법 가이드를 참조하십시오.
IF, IHC 및 FISH에서 SuperBoost 티라미드 기반 증폭의 예
SuperBoost 티라미드 신호 키트는 다양한 기타 마커 검출 및 세포 염색 기법과 호환되어 복합 실험 및 형광 동시 발현 연구를 가능하게 합니다. SuperBoost 티라미드 신호 키트는 표준 ICC, IHC 및 FISH 분석법에서 일반적으로 사용되는 세포 유형 및 형광 이미징 시스템과 함께 사용됩니다. 당사는 2D 및 3D 배양, FFPE 조직 및 극저온 절편 조직에서 포름알데히드 고정 세포주를 사용하여 SuperBoost 티라미드 신호 키트의 성능을 테스트했습니다.
SuperBoost 티라미드 신호 시약 복합 분석은 다음과 함께 수행할 수 있습니다.
- DAPI와 같은 대조 염색용 형광 마커
- 형광 단백질(예: GFP & RFP)
- 표준 ICC/IHC
- 기타 SuperBoost 티라미드 신호 키트
IHC 및 FFPE 시료에 사용
시료 유형: 쥐 장 절편(FFPE)
항체:H2B, 액틴 및 Ki-67에 대한 3가지 1차 항체로 순차적으로 면역라벨링했습니다.
분석법(Method): 각 항체 라벨링 사이에서 시료는 고온에서 끓을 때까지(~2분) 구연산염 완충액 pH6 (citrate buffer pH6)에서 마이크로파 처리한 다음 20% 전력에서 15분 동안 마이크로파 처리하고 토끼 항체로 라벨링하기 전에 실온에서 냉각되도록 했습니다. 그런 다음 시료를 다음과 같이 3가지 종류의 1차 항체로 라벨링했습니다. Alexa Fluor 647 티라미드 SuperBoost 키트로 검출된 항H2B (Green), Alexa Fluor 488 티라미드 SuperBoost 키트로 검출된 rabbit anti–smooth muscle actin antibody (Red), Alexa Fluor 594 티라미드 SuperBoost 키트로 검출된 rabbit anti-Ki67 antibody.
세포 배양에서 ICC에 사용
시료 유형: 고정 및 투과화된 HeLa 세포
항체:항-ATP 합성효소 항체 및 항-β-카테닌 항체에 대한 3가지 1차 항체를 사용하여 면역라벨링했습니다.
분석법(Method): 세포는 항-ATP 합성효소 항체 및 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체로 라벨링했습니다. 또한 이 세포를 항-β-카테닌 항체와 함께 배양하고 Alexa Fluor 488 티라미드 SuperBoost 키트(goat anti–mouse IgG and Alexa Fluor 488티라미드)의 시약으로 라벨링했습니다. 핵은 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 시약으로 라벨링했습니다. 공초점 현미경으로 이미지를 획득했습니다.
FISH 및 세포 배양에 사용
시료 유형: 고정 및 투과화된 U2OS 세포
항체: 항-Cas9 항체로 면역라벨링하고 hprt 유전자를 표적으로 한 올리고를 사용하여 프로빙했습니다.
분석법(Method): U2OS 세포를 고정 및 투과화한 다음 hprt 유전자 프로브와 비활성 Cas9 단백질을 사용하여 배양했습니다. hprt 프로브는 sg-RNA를 포함하는 Cas9 식별을 위해 설계되었습니다. hprt 유전자 자리(loci)에서 조립된 Cas9 단백질 및 hprt 프로브 복합제를 검출하기 위해 항-Cas9 항체를 사용했습니다. 이 1차 항체는 hprt 유전자좌를 특이적으로 검출하는 Alexa Fluor 488 티라미드 SuperBoost 키트(goat anti–mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide 생쥐 IgG 및 Alexa Fluor 488 티라미드)에 의해 검출되었습니다. 핵은 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 시약으로 라벨링했습니다. EVOS FL 자동 이미징 시스템에서 이미지를 획득하고 분석했습니다(EVOS 이미징 시스템 정보 참조).
표준 ICC/IHC에 사용
시료 유형: 배양 HeLa 세포, 고정 및 투과화됨
항체: 세포는 항-ATP 합성효소 소단위 IF1 항체로 면역라벨링했습니다.
분석법(Method):Image-iT 고정/투과화 키트의 시약을 사용하여 처리한 고정 및 투과화 HeLa 세포를 항튜불린 1차 항체 및 Alexa Fluor 488 염소 항-생쥐 IgG(H+L) 2차 항체와 함께 배양했습니다. 그런 다음 세포를 항-ATP 합성효소 소단위 IF1 항체와 함께 배양하고 Alexa Fluor 594 티라미드 SuperBoost 키트(염소 항-생쥐 IgG 및 Alexa Fluor 594 티라미드)의 시약으로 라벨링했습니다. 핵은 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 시약으로 라벨링했습니다. 공초점 현미경으로 이미지를 획득했습니다.
다른 SuperBoost 키트 사용
시료 유형: 배양 HeLa 세포, 고정 및 투과화됨
항체: HeLa 세포를 항프로히비틴 항체로 면역라벨링했습니다.
분석법(Method):Image-iT 고정/투과화 키트의 시약을 사용하여 처리된 고정 및 투과화 HeLa 세포를 항프로히비틴 항체와 함께 배양하고 Alexa Fluor 647 티라미드 SuperBoost 키트(염소 항-토끼 IgG 및 Alexa Fluor 647 티라미드)의 시약으로 라벨링했습니다. 또한 이 세포를 항-β-카테닌과 함께 배양하고 Alexa Fluor 488 티라미드 SuperBoost 키트 (goat anti–mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide)의 시약으로 라벨링했습니다. 핵은 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 시약으로 라벨링했습니다. 공초점 현미경으로 이미지를 획득했습니다.
주문 정보
티라미드 SuperBoost 키트 주문 정보
| 라벨링된 티라미드(Ex/Em) |
티라미드 SuperBoost 키트*
| ||
|---|---|---|---|
Anti–mouse IgG (host: goat)
|
Anti–rabbit IgG (host: goat)
|
스트렙타비딘
| |
| Alexa Fluor 488(495/519 nm) | B40912 B40941 (50 coverslips) | B40922 B40943 (50 coverslips) | B40932 |
| Alexa Fluor 555(555/565 nm) | B40913 | B40923 | B40933 |
| Alexa Fluor 594(591/617 nm) | B40915 B40942 (50 coverslips) | B40925 B40944 (50 coverslips) | B40935 |
| Alexa Fluor 647(650/668 nm) | B40916 | B40926 | B40936 |
| Biotin-XX | B40911 | B40921 | B40931 |
| * 달리 명시하지 않는 한, 최대 150개의 18 mm x 18 mm 커버슬립에 충분한 재료가 제공됩니다(가장 중요한 배양 단계에서 150 μL을 사용하는 경우). 용량은 다양한 크기의 시료에 맞게 조정할 수 있습니다. | |||
독립형 티라미드 SuperBoost 시약 주문 정보
SlowFade antifade 주문 정보
TSA 시약으로 스트리핑 및 재프로빙할 때 SlowFade antifade를 사용하십시오.
스트리핑 및 재염색을 비롯한 SuperBoost 티라미드 신호 및 애플리케이션을 위한 프로토콜
주요 리소스
자세한 사용법 관련 선별 문헌
- Avens HJ, Berron BJ, May AM, Voigt KR, Seedorf GJ, Balasubramaniam V, Bowman CN. Sensitive immunofluorescent staining of cells via generation of fluorescent nanoscale polymer films in response to biorecognition. J Histochem Cytochem. 2011 Jan;59(1):76-87. PMID: 21339175 .
- Kosmac K, Peck BD, Walton RG, Mula J, Kern PA, Bamman MM, Dennis RA, Jacobs CA, Lattermann C, Johnson DL, Peterson CA. Immunohistochemical Identification of Human Skeletal Muscle Macrophages. Bio Protoc. 2018 Jun 20;8(12):e2883. PMID: 30148186 .
- Tóth ZE, Mezey E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. J Histochem Cytochem. 2007 Jun;55(6):545-54. PMID: 17242468 .
리소스
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