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Live-Cell 이미징동적인 이미징 실험을 위해 Live-Cell을 염색하기 위한 간단한 단계에 대해 알아보세요. |
Live-Cell의 형광 이미징은 동적인 세포 내 대사 과정을 관찰하고 시간 경과에 따른 세포 생체분자 및 구조를 추적하는 데 사용됩니다. Live-Cell 형광 이미징을 통해 연구자들은 세포 기능이 보존된 원형(native) 상태의 세포를 검사할 수 있으며, 세포골격 재배열, 세포사멸(apoptosis), 세포 이동, 세포내섭취(endocytosis), 식세포작용(phagocytosis), 약물 발견, 암, 발달 생물학, 환경 과학 및 기타 의학 연구 분야에서 보다 관련성이 높은 연구 결과를 얻기 위한 소기관 역학 등의 세포 내 대사 과정을 연구할 수 있습니다.
이 가이드를 사용하여 Live-Cell 이미징 실험을 구성하고 시약을 선택하며 고품질의 데이터를 생성해보세요.
Live-Cell 이미징 시약에는 표적 형광 단백질과 작은 막투과성 형광 염료 등이 있습니다. Live-Cell 이미징 실험을 위해, 많은 시약은 수 시간 또는 며칠에 걸친 타임 랩스(time-lapse)를 위해 디자인되었으며, 또한 염색 직후 세포를 이미지화하고 분석하는 end-point 어세이에 최적화된 시약들도 있습니다. 세포 독성을 최소화하고 세포 기능을 보존하려면 염색 농도, 인큐베이션 시간, 적절한 시간 범위 및 이미징 간격/빈도를 경험적으로 결정해야 합니다.
아래 Live-Cell 이미징 가이드에 있는 시약은 다음의 자동화된 하이-컨텐트(high-content) 및 인큐베이터 기반 형광 이미징 시스템과 호환됩니다: Thermo Fisher Scientific’s EVOS M7000 and M5000 Cell Imaging Systems with EVOS Onstage Incubator, CellInsight HCS Platforms, PerkinElmer’s MuviCyte™ live-cell imaging system*, Leica’s Thunder and Mica*, Sartorius’ Incucyte® Live-Cell Analysis System™*.
인큐베이터와 결합된 형광 이미징 플랫폼은 자연 상태에서 세포를 장시간 이미징할 수 있는 제어되고 안정적인 환경을 제공합니다. EVOS M7000 및 M5000 세포 이미징 시스템용EVOS Onstage Incubator와 CellInsight HCS/HCA 플랫폼의 자동 하이 컨텐트 스크리닝 및 분석용Invitrogen HCA Onstage Incubator를 사용하여 환경 챔버 내에서 Live-Cell에 대한 타임-랩스 및 키네틱 이미징과 분석을 수행할 수 있습니다. 인큐베이션 환경에서 장시간 Live-Cell 이미징을 수행할 때, 5% CO2 환경에서 생리적 pH를유지하기 위해 시약은 전통적인 세포 배양 배지 또는 FluoroBrite DMEM (카탈로그 번호 A1896701)에서 bicarbonate로 완충하여 사용해야 합니다.
apoptosis는 과도하게 손상되고 불필요한 세포나 조직을 제거하는 데 사용되는 엄격하게 제어되고 프로그래밍된 세포 사멸 과정입니다. apoptosis는 caspase 활성화, DNA 단편화, 활성 미토콘드리아의 분열 및 원형질막 변화를 통해 감지될 수 있습니다. CellEvent Caspase 3/7 reagents는 Live-Cell에서 apoptosis를 분석하기 위해 caspase 활성화를 감지하는 형광성 caspase 기질입니다. 이 시약은 세척 단계가 필요하지 않으며 48시간 이상 apoptosis의 실시간 및 타임-랩스 Live-Cell 이미징에 사용할 수 있습니다.
그림 1. CellEventCaspase-3/7 Green Detection Reagent (카탈로그 번호 C10432)를 사용한 Apoptosis Live-Cell end point assay workflow. 세포를 시딩한 후 처리하였습니다. 희석된 CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent를 세포에 추가하였습니다. CellEvent Caspase 3/7 dyes는 세척(wash) 없이 완전 배지에서 직접 세포를 이미징할 수 있습니다. 빠르면 30분부터 길게는 72시간까지 형광을 측정할 수 있습니다.
그림 2. CellEvent Caspase 3/7 Green으로 염색된 apoptotic 세포의 Live-Cell 이미징의 예.CellEvent Caspase 3/7 Green Assay (카탈로그 번호 C10432)로 염색된 칵테일로 처리하고, 처리 후에 Incucyte® ZOOM Live-Cell Analysis System으로 0, 24, 48, 72시간에 이미징한 HuVEC 세포. (이미지 출처: Sambi M, Samuel V, Qorri B, Haq S, Burov SV, Markvicheva E, Harless W, Szewczuk MR. A Triple Combination of Metformin, Acetylsalicylic Acid, and Oseltamivir Phosphate Impacts Tumour Spheroid Viability and Upends Chemoresistance in Triple-Negative Breast Cancer. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1995-2019 PMID: 32546966)
Live-Cell 이미징 시약에는 세포 구성 요소를 식별하는 데 사용되는 세포 구조 시약과 세포 기능과 과정을 분석하기 위한 세포 기능 시약이 모두 포함됩니다. 예를 들어, MitoTracker 염료는 Live-Cell의 활성 미토콘드리아에 축적되고 미토콘드리아에 공유 결합되어 미토콘드리아 위치 및 존재비를 평가할 수 있습니다. 반면, TMRM 및 TMRE는 막전위에 따라 미토콘드리아 안팎으로 변동하는 동적인 미토콘드리아 막전위 인디케이터 염료입니다.
그림 3. Live-Cell의 활성 미토콘드리아 모니터링.MitoTrackerRed (카탈로그 번호 M22426), Image-iT DEAD Green dyes (카탈로그 번호 I10291), Hoechst (카탈로그 번호 R37165) 로 배양 및 염색하고 Incucyte® ZOOM Live-Cell Analysis System에서 이미징한 환자의 섬유아세포주. (이미지 출처: Smith GA, Jansson J, Rocha EM, Osborn T, Hllett PJ, Isacson O. Fibroblast Biomarkers of Sporadic Parkinson’s Disease and LRRK2 Kinase Inhibition. Mol Neurobiol. 2016 Oct;53(8):5161-77. PMCID: PMC5012155. )
다양한 실험 조작, 검출, 이미징 동안 세포를 살아 있게 하고 건강하게 유지하는 것은 쉬운 작업이 아닙니다. 배지 선택은 세포가 장시간 주변 조건에 노출되는 타임-랩스 이미징 및 실험에 특히 중요합니다. Live-Cell에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 세포가 건강해야 하며 생리적 온도, pH, 산소 수준 및 기타 조건을 최대한 잘 유지해야 합니다.
이러한 배지 및 세척 버퍼는 Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작되었습니다. 실험에 이 제품을 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
도움말Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작된 배지 및 세척 버퍼를 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화할 수 있습니다. 제품 선택 가이드 보기 |
표적 세포 구조 또는 프로세스를 모니터링하려면 적절한 fluorophore(표적 형광 단백질 또는 소형 막 투과 시약)를 사용해야 합니다. 추가적인 fluorophore를 사용하여 여러 세포 구조와 프로세스를 모니터링할 수 있지만, Fluorescence SpectraViewer를 사용하여 excitation 및 emission 스펙트럼을 확인하여 스펙트럼 중복을 최소화해야 합니다. 형광 라벨을 너무 많이 사용하면 다음과 같은 결과가 발생할 수 있으므로 형광 라벨을 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요합니다:
도움말
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세포외(extracellular) 형광을 줄이고 fluorophore 광안정성을 높이는 시약을 사용하여 신호 대 백그라운드 비율을 최적화할 수 있습니다. Live-Cell 이미징 실험에서 백그라운드 형광을 줄이거나 제거하는 동시에 세포 건강을 유지하기 위해 특별히 설계된 배지에서 이미지를 생성하는 것이 중요합니다(표 1 참조). 또한 Live-Cell과 호환되는 백그라운드 서프레서를 추가하면 세포외(extracellular) 백그라운드 형광을 줄이고 세척 단계가 필요하지 않습니다. Live-Cell을 위한 광퇴색(Antifade) 방지 마운팅 배지(mounting media)를 시료에 적용하여 fluorophore의 광표백을 줄임으로써 다중 노출 또는 장시간 노출로 인한 신호 손실을 방지할 수 있습니다.
표 1. 이미징 배지(media) 비교.
시약 | 세포 세척 | 단시간 이미징 | 최대 4시간 이미징 | 장시간 이미징 |
---|---|---|---|---|
Gibco PBS, pH 7.4 | ![]() | ![]() | ||
Gibco FluoroBrite DMEM | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() |
Tubulin Tracker Green dye와 Tubulin Tracker Deep Red dye로 라벨링한 HeLa Live-Cell. 프로브가 염색 용액에 남아 있을 때 두 라벨 모두 높은 세포외 백그라운드를 나타냅니다(왼쪽). BackDrop Background Suppressor를 추가하면 세포내 라벨링에 영향을 주지 않으면서 세포외 백그라운드가 크게 감소하므로(오른쪽), Live-Cell에서 tublin 고대비 이미징을 위한 no-wash 프로토콜이 가능해집니다.
처리되지 않은 시료와 비교한 ProLong Live reagent가 제공하는 전반적인 신호 보호는 처리된 시료와 처리되지 않은 시료가 EC50 값에 도달하는 스캔 수를 기준으로 계산됩니다. Invitrogen CellLight Mitochondria-RFP reagent와 함께 ProLong Live reagent를 추가하면 100% 더 많이 캡처할 수 있습니다.
표준 타임 랩스(time-lapse) 이미징 프로토콜을 사용하여 120번 노출한 후, ProLong Live reagent로 처리된 시료는 처리되지 않은 세포에 비해 20% 이상 더 밝아 더 많은 데이터 수집 타임이 가능해집니다.
도움말
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광독성을 최소화하려면 광원을 최대한 제어할 수 있는 이미징 시스템을 선택하세요. 낮은 백그라운드로 우수한 신호를 생성하는 동시에, 세포에 가해지는 빛의 강도, 노출 시간, 파장 범위, excitation 에너지의 양을 최소화해보세요. 가장 낮은 수준의 fluorophore excitation로 가장 높은 신호를 제공하는 광원을 사용해보세요. 경우에 따라(특히 장시간 영상을 촬영하고자 할 경우), 더 건강한 세포를 얻기 위해 더 짧은 노출 시간이나 더 낮은 배율을 사용하여 해상도를 희생하는 것이 좋습니다.
장시간에 걸친 Live-Cell 이미징은 실험 과정에서 표적이 초점에서 벗어날 수 있기 때문에 어려운 점이 있습니다. 많은 현미경에는 대상의 초점을 더 오랫동안 유지하고 초점 드리프트를 줄이는 데 도움이 되는 자동 초점 기능이 있습니다. 또한, 세포를 일정한 온도로 유지하고 vessel 내 용액의 부피를 일정하게 유지하면 초점 드리프트에 도움이 됩니다.
많은 세포는 최적의 온도, 삼투압, pH, 습도를 벗어나면 견디기가 어렵습니다. 요구 사항은 실험에 따라 다릅니다. 예를 들어, 세포 성장 및 분열을 조사하는 실험은 수용체 활성화 및 칼슘 축적을 포함한 실험과는 다른 요구 사항을 가질 수 있습니다. 일부 강력한 불멸 세포주는 환경 제어 없이 짧은 시간 동안의 이미지화 또는 모니터링을 견딜 수 있습니다. 그러나, 장시간의 이미징 및 검출 연구에서 불멸 세포와 일차 세포 모두 좋은 결과를 얻기 위해서는 일반적으로 엄격하게 제어되는 환경 매개변수가 필요합니다.
Invitrogen CellTracker Deep Red Dye가 로딩된 HDFn 세포 배양물의 스크래치 손상.(A) 빛이 조사된 영역은 10시간 동안 반복적으로 빛이 조사되었습니다. 이 영역의 세포는 광독성 징후를 보입니다(세포가 손상 부위로 성장해 나갈 수 없어 viability 상실). (B) 빛이 조사되지 않은 영역의 세포는 손상 부위 내로 생존력이 있는 세포 성장을 보여줍니다.
상단의 세포는 과도한 광 노출로 인해 발생하는 세포막의 치명적인 수포형성(blebbing)을 보여줍니다. 수포형성(blebbing)은 독성으로 인한 막 교란을 설명하는 데 사용되는 용어입니다. 반대로, 하단의 세포는 상대적으로 건강한 상태를 유지하며 비정상적인 형태를 나타내지 않습니다.
실험에서 건강하지 않은 세포를 사용하여 다음 단계를 진행하는 것을 피하기 위해, Countess III FL Automated Cell Counter에서 세포 건강을 빠르게 확인할 수 있으며, 다양한 형광 시약을 함께 사용하면 세포 생존율, 세포사멸, 세포 독성, 트랜스펙션 효율을 검출할 수 있습니다. 재사용 가능한 슬라이드 옵션으로 비용을 절감할 수 있습니다.
Invitrogen EVOS 이미징 시스템용으로 특별히 설계된 Invitrogen EVOS Onstage Incubator는 생리학적, 비생리학적 조건 모두에서 Live-Cell의 타임 랩스(time-lapse) 이미징을 위해 온도, 습도 및 세 가지 가스를 정밀하게 제어할 수 있는 환경 챔버입니다.
Thermo Scientific CellInsight HCA 플랫폼용 Invitrogen HCA Onstage Incubator는 온도, 습도, CO2 농도를 정밀하게 제어할 수 있으므로 시간 경과에 따른 생물학적 활성과 변화를 관찰하고 측정할 수 있습니다. 장시간 이미징 연구에서 수집된 데이터는 정량적 분석 연구의 기반이 되며, 특히 Thermo Scientific HCS Studio Software와 결합하면 통계적인 성능을 향상시킬 수 있습니다.
도움말
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다양한 실험 조작, 검출, 이미징 동안 세포를 살아 있게 하고 건강하게 유지하는 것은 쉬운 작업이 아닙니다. 배지 선택은 세포가 장시간 주변 조건에 노출되는 타임-랩스 이미징 및 실험에 특히 중요합니다. Live-Cell에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 세포가 건강해야 하며 생리적 온도, pH, 산소 수준 및 기타 조건을 최대한 잘 유지해야 합니다.
이러한 배지 및 세척 버퍼는 Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작되었습니다. 실험에 이 제품을 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
도움말Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작된 배지 및 세척 버퍼를 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화할 수 있습니다. 제품 선택 가이드 보기 |
표적 세포 구조 또는 프로세스를 모니터링하려면 적절한 fluorophore(표적 형광 단백질 또는 소형 막 투과 시약)를 사용해야 합니다. 추가적인 fluorophore를 사용하여 여러 세포 구조와 프로세스를 모니터링할 수 있지만, Fluorescence SpectraViewer를 사용하여 excitation 및 emission 스펙트럼을 확인하여 스펙트럼 중복을 최소화해야 합니다. 형광 라벨을 너무 많이 사용하면 다음과 같은 결과가 발생할 수 있으므로 형광 라벨을 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요합니다:
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세포외(extracellular) 형광을 줄이고 fluorophore 광안정성을 높이는 시약을 사용하여 신호 대 백그라운드 비율을 최적화할 수 있습니다. Live-Cell 이미징 실험에서 백그라운드 형광을 줄이거나 제거하는 동시에 세포 건강을 유지하기 위해 특별히 설계된 배지에서 이미지를 생성하는 것이 중요합니다(표 1 참조). 또한 Live-Cell과 호환되는 백그라운드 서프레서를 추가하면 세포외(extracellular) 백그라운드 형광을 줄이고 세척 단계가 필요하지 않습니다. Live-Cell을 위한 광퇴색(Antifade) 방지 마운팅 배지(mounting media)를 시료에 적용하여 fluorophore의 광표백을 줄임으로써 다중 노출 또는 장시간 노출로 인한 신호 손실을 방지할 수 있습니다.
표 1. 이미징 배지(media) 비교.
시약 | 세포 세척 | 단시간 이미징 | 최대 4시간 이미징 | 장시간 이미징 |
---|---|---|---|---|
Gibco PBS, pH 7.4 | ![]() | ![]() | ||
Gibco FluoroBrite DMEM | ![]() | ![]() | ![]() | ![]() |
Tubulin Tracker Green dye와 Tubulin Tracker Deep Red dye로 라벨링한 HeLa Live-Cell. 프로브가 염색 용액에 남아 있을 때 두 라벨 모두 높은 세포외 백그라운드를 나타냅니다(왼쪽). BackDrop Background Suppressor를 추가하면 세포내 라벨링에 영향을 주지 않으면서 세포외 백그라운드가 크게 감소하므로(오른쪽), Live-Cell에서 tublin 고대비 이미징을 위한 no-wash 프로토콜이 가능해집니다.
처리되지 않은 시료와 비교한 ProLong Live reagent가 제공하는 전반적인 신호 보호는 처리된 시료와 처리되지 않은 시료가 EC50 값에 도달하는 스캔 수를 기준으로 계산됩니다. Invitrogen CellLight Mitochondria-RFP reagent와 함께 ProLong Live reagent를 추가하면 100% 더 많이 캡처할 수 있습니다.
표준 타임 랩스(time-lapse) 이미징 프로토콜을 사용하여 120번 노출한 후, ProLong Live reagent로 처리된 시료는 처리되지 않은 세포에 비해 20% 이상 더 밝아 더 많은 데이터 수집 타임이 가능해집니다.
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광독성을 최소화하려면 광원을 최대한 제어할 수 있는 이미징 시스템을 선택하세요. 낮은 백그라운드로 우수한 신호를 생성하는 동시에, 세포에 가해지는 빛의 강도, 노출 시간, 파장 범위, excitation 에너지의 양을 최소화해보세요. 가장 낮은 수준의 fluorophore excitation로 가장 높은 신호를 제공하는 광원을 사용해보세요. 경우에 따라(특히 장시간 영상을 촬영하고자 할 경우), 더 건강한 세포를 얻기 위해 더 짧은 노출 시간이나 더 낮은 배율을 사용하여 해상도를 희생하는 것이 좋습니다.
장시간에 걸친 Live-Cell 이미징은 실험 과정에서 표적이 초점에서 벗어날 수 있기 때문에 어려운 점이 있습니다. 많은 현미경에는 대상의 초점을 더 오랫동안 유지하고 초점 드리프트를 줄이는 데 도움이 되는 자동 초점 기능이 있습니다. 또한, 세포를 일정한 온도로 유지하고 vessel 내 용액의 부피를 일정하게 유지하면 초점 드리프트에 도움이 됩니다.
많은 세포는 최적의 온도, 삼투압, pH, 습도를 벗어나면 견디기가 어렵습니다. 요구 사항은 실험에 따라 다릅니다. 예를 들어, 세포 성장 및 분열을 조사하는 실험은 수용체 활성화 및 칼슘 축적을 포함한 실험과는 다른 요구 사항을 가질 수 있습니다. 일부 강력한 불멸 세포주는 환경 제어 없이 짧은 시간 동안의 이미지화 또는 모니터링을 견딜 수 있습니다. 그러나, 장시간의 이미징 및 검출 연구에서 불멸 세포와 일차 세포 모두 좋은 결과를 얻기 위해서는 일반적으로 엄격하게 제어되는 환경 매개변수가 필요합니다.
Invitrogen CellTracker Deep Red Dye가 로딩된 HDFn 세포 배양물의 스크래치 손상.(A) 빛이 조사된 영역은 10시간 동안 반복적으로 빛이 조사되었습니다. 이 영역의 세포는 광독성 징후를 보입니다(세포가 손상 부위로 성장해 나갈 수 없어 viability 상실). (B) 빛이 조사되지 않은 영역의 세포는 손상 부위 내로 생존력이 있는 세포 성장을 보여줍니다.
상단의 세포는 과도한 광 노출로 인해 발생하는 세포막의 치명적인 수포형성(blebbing)을 보여줍니다. 수포형성(blebbing)은 독성으로 인한 막 교란을 설명하는 데 사용되는 용어입니다. 반대로, 하단의 세포는 상대적으로 건강한 상태를 유지하며 비정상적인 형태를 나타내지 않습니다.
실험에서 건강하지 않은 세포를 사용하여 다음 단계를 진행하는 것을 피하기 위해, Countess III FL Automated Cell Counter에서 세포 건강을 빠르게 확인할 수 있으며, 다양한 형광 시약을 함께 사용하면 세포 생존율, 세포사멸, 세포 독성, 트랜스펙션 효율을 검출할 수 있습니다. 재사용 가능한 슬라이드 옵션으로 비용을 절감할 수 있습니다.
Invitrogen EVOS 이미징 시스템용으로 특별히 설계된 Invitrogen EVOS Onstage Incubator는 생리학적, 비생리학적 조건 모두에서 Live-Cell의 타임 랩스(time-lapse) 이미징을 위해 온도, 습도 및 세 가지 가스를 정밀하게 제어할 수 있는 환경 챔버입니다.
Thermo Scientific CellInsight HCA 플랫폼용 Invitrogen HCA Onstage Incubator는 온도, 습도, CO2 농도를 정밀하게 제어할 수 있으므로 시간 경과에 따른 생물학적 활성과 변화를 관찰하고 측정할 수 있습니다. 장시간 이미징 연구에서 수집된 데이터는 정량적 분석 연구의 기반이 되며, 특히 Thermo Scientific HCS Studio Software와 결합하면 통계적인 성능을 향상시킬 수 있습니다.
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50 mM menadione으로 처리한 U2OS 세포. Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)(카탈로그 번호 T668) 미토콘드리아 전위 인디케이터 및 CellROX Green reagent (카탈로그 번호 C10444)으로 표시된 대로 산화 스트레스로 인한 퇴색.
Tubulin Tracker Deep Red (카탈로그 번호 T34076)로 라벨링된 해마 뉴런.
CellLight Tubulin-GFP (카탈로그 번호 C10613); CellLight Actin-RFP (카탈로그 번호 C10583)로 트랜스펙션된 U2OS 세포.
포스터: Live-Cell 현미경 검사에서 카스파제(caspase) 활성화 및 미토콘드리아 초산화물을 위한 차세대 센서
포스터: 마이크로플레이트 리더 검사를 사용한 2D 및 3D 세포 모델의 새롭고 향상된 세포 건강 평가
포스터: 형광 현미경 검사와 high-content 이미징을 사용한 live cell 및 fixed cell의 저산소증 측정
포스터: 형광 특성 분석을 통한 세포 노화 평가
*Incucyte ® Live-Cell Analysis System은 Essen BioScience의 상표 또는 등록 상표입니다. Incucyte, Essen BioScience 및 Essen BioScience의 모든 제품명은 별도로 명시되지 않는 한 Essen BioScience의 등록 상표 및 재산입니다. Essen BioScience는 Sartorius Company입니다. MuviCyte™ Live-Cell 이미징 시스템은 PerkinElmer의 상표 또는 등록 상표입니다. THUNDER Imager Live-Cell & 3D Assay 및 MICA Microhub Microscope는 Leica Microsystems CMS GmbH에서 판매합니다.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.