형광 Live-Cell 이미징이란 무엇입니까?

Live-Cell의 형광 이미징은 동적인 세포 내 대사 과정을 관찰하고 시간 경과에 따른 세포 생체분자 및 구조를 추적하는 데 사용됩니다. Live-Cell 형광 이미징을 통해 연구자들은 세포 기능이 보존된 원형(native) 상태의 세포를 검사할 수 있으며, 세포골격 재배열, 세포사멸(apoptosis), 세포 이동, 세포내섭취(endocytosis), 식세포작용(phagocytosis), 약물 발견, 암, 발달 생물학, 환경 과학 및 기타 의학 연구 분야에서 보다 관련성이 높은 연구 결과를 얻기 위한 소기관 역학 등의 세포 내 대사 과정을 연구할 수 있습니다.

이 가이드를 사용하여 Live-Cell 이미징 실험을 구성하고 시약을 선택하며 고품질의 데이터를 생성해보세요.

인큐베이터 또는 현미경이 있는 이미징 플랫폼을 위한 Live-Cell 실험 구성

Live-Cell 이미징을 위한 시약 선택 방법

Live-Cell 이미징 시약에는 표적 형광 단백질과 작은 막투과성 형광 염료 등이 있습니다. Live-Cell 이미징 실험을 위해, 많은 시약은 수 시간 또는 며칠에 걸친 타임 랩스(time-lapse)를 위해 디자인되었으며, 또한 염색 직후 세포를 이미지화하고 분석하는 end-point 어세이에 최적화된 시약들도 있습니다. 세포 독성을 최소화하고 세포 기능을 보존하려면 염색 농도, 인큐베이션 시간, 적절한 시간 범위 및 이미징 간격/빈도를 경험적으로 결정해야 합니다.

아래 Live-Cell 이미징 가이드에 있는 시약은 다음의 자동화된 하이-컨텐트(high-content) 및 인큐베이터 기반 형광 이미징 시스템과 호환됩니다: Thermo Fisher Scientific’s  EVOS M7000 and M5000 Cell Imaging Systems with EVOS Onstage Incubator, CellInsight HCS Platforms, PerkinElmer’s MuviCyte™ live-cell imaging system*, Leica’s Thunder and Mica*, Sartorius’ Incucyte® Live-Cell Analysis System™*.

 EVOS DAPI 라이트 큐브EVOS GFP 라이트 큐브
Excitation: 470/22 nm;
Emission: 510/42 nm
EVOS RFP 라이트 큐브 Excitation: 531/40 nm; Emission: 593/40 nm EVOS Red 라이트 큐브 Excitation: 585/29 nm; Emission: 624/40 nm EVOS Cy5 라이트 큐브 Excitation: 628/40 nm; Emission: 693/40 nm Live-Cell 이미징 시간 범위
Incucyte Green 필터Incucyte Orange 필터Incucyte Red 필터Incucyte NIR 필터
항체 내재화(Antibody internalization) 

pHrodo Green iFL antibody labeling reagents

 

pHrodo Red iFL antibody labeling reagents

 pHrodo Deep Red antibody labeling reagentsLong-term (hours to overnight)
Apoptosis CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent

 

CellEvent Caspase-3/7 Red Detection Reagent Long-term (overnight to 48-72 hours)
Autophagy Premo Autophagy Sensors (p62 and LC3B) GFPPremo Autophagy Sensors (p62 and LC3B) RFP  Long-term (overnight to 48 hours)
세포 추적(Cell tracking)CellTracker dyesShort- to long-term (72 hours/~3 or more generations)
세포골격 (actin) CellMask Green Actin Tracking StainCellMask Orange Actin Tracking Stain CellMask Deep Red Actin Tracking StainShort- to long-term (24+ hours)
세포골격 (tubulin) Tubulin Tracker Green  Tubulin Tracker Deep RedShort-term
Endosomes/endocytosis pHrodo and Alexa Fluor dextransShort- to long-term (minutes to hours; overnight or longer for some applications)
리간드 내재화(Ligand internalization) Alexa Fluor, BODIPY, and pHrodo LDL conjugatesShort- to long-term (minutes to overnight or longer)
Alexa Fluor and pHrodo EGF and transferrin conjugates
Endoplasmic reticulum ER-Tracker Green

ER-Tracker Red

End-point
저산소증(Hypoxia) Image-iT Green Hypoxia Reagent   End-point 
칼슘 Fluo-4 Calcium Imaging KitRhod-3 Calcium Imaging Kit  Short-term (minutes to hours)
리소좀LysoTracker and LysoSensor dyesShort-term (minutes to hours)
Membranes (plasma and internal) Vybrant cell labeling solutionsLong-term
미토콘드리아 구조 MitoTracker dyesLong-term
미토콘드리아 기능  TMRM  Short-term (minutes to hours)
TMRE
HCS NuclearMask Blue StainSYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain HCS NuclearMask Red StainHCS NuclearMask Deep Red StainEnd-point
Hoechst 33342   NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent
NucBlue Live ReadyProbes Reagent   DRAQ5 Fluorescent Probe Solution
원형질막 CellMask Green Plasma Membrane StainCellMask Orange Plasma Membrane Stain CellMask Deep Red Plasma Membrane StainShort-term (10-90 minutes, can image longer but will internalize)
반응성 산소 종 CellROX Green ReagentCellROX Orange Reagent CellROX Deep Red ReagentLong-term (24 hours)
 H2DCFDA dyes   Short-term (~2 hours)
ThiolTracker VioletMitoSOX Green Superoxide Indicator   End-point
Phagocytosis pHrodo Green BioParticles ConjugatespHrodo Red BioParticles Conjugates pHrodo Deep Red BioParticles ConjugatesShort- to long-term (minutes to hours or longer)
생존율Calcein Blue, AMCalcein, AM, cell-permeant dye   Short-term (minutes to hours)  
 SYTOX Green Acid StainSYTOX Orange Nucleic Acid Stain SYTOX Deep Red Nucleic Acid Stain
 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Green/Deep Red)  LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Green/Deep Red)
형광 단백질 기반 세포 구조 시약 CellLight GFP BacMam 2.0CellLight RFP BacMam 2.0  Long-term (overnight to days/2-3 generations)

Live-Cell 이미징 중 환경 제어를 유지하는 방법

인큐베이터와 결합된 형광 이미징 플랫폼은 자연 상태에서 세포를 장시간 이미징할 수 있는 제어되고 안정적인 환경을 제공합니다. EVOS M7000 및 M5000 세포 이미징 시스템용EVOS Onstage Incubator와 CellInsight HCS/HCA 플랫폼의 자동 하이 컨텐트 스크리닝 및 분석용Invitrogen HCA Onstage Incubator를 사용하여 환경 챔버 내에서 Live-Cell에 대한 타임-랩스 및 키네틱 이미징과 분석을 수행할 수 있습니다. 인큐베이션 환경에서 장시간 Live-Cell 이미징을 수행할 때, 5% CO2 환경에서 생리적 pH를유지하기 위해 시약은 전통적인 세포 배양 배지 또는 FluoroBrite DMEM (카탈로그 번호 A1896701)에서 bicarbonate로 완충하여 사용해야 합니다.

예: Live-Cell 이미징 실험에서의 apoptosis

apoptosis는 과도하게 손상되고 불필요한 세포나 조직을 제거하는 데 사용되는 엄격하게 제어되고 프로그래밍된 세포 사멸 과정입니다. apoptosis는 caspase 활성화, DNA 단편화, 활성 미토콘드리아의 분열 및 원형질막 변화를 통해 감지될 수 있습니다. CellEvent Caspase 3/7 reagents는 Live-Cell에서 apoptosis를 분석하기 위해 caspase 활성화를 감지하는 형광성 caspase 기질입니다. 이 시약은 세척 단계가 필요하지 않으며 48시간 이상 apoptosis의 실시간 및 타임-랩스 Live-Cell 이미징에 사용할 수 있습니다.

CellEvent Caspase 3/7 workflow

그림 1. CellEventCaspase-3/7 Green Detection Reagent (카탈로그 번호 C10432)를 사용한 Apoptosis Live-Cell end point assay workflow. 세포를 시딩한 후 처리하였습니다.  희석된 CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent를 세포에 추가하였습니다. CellEvent Caspase 3/7 dyes는 세척(wash) 없이 완전 배지에서 직접 세포를 이미징할 수 있습니다. 빠르면 30분부터 길게는 72시간까지 형광을 측정할 수 있습니다.

Caspase 3/7 프로토콜 다운로드

Cells stained with CellEvent Caspase 3/7 Green as indicated with apoptotic cells being bright green and live cells being dark, and imaged with Incucyte® ZOOM Live-Cell Analysis

그림 2. CellEvent Caspase 3/7 Green으로 염색된 apoptotic 세포의 Live-Cell 이미징의 예.CellEvent Caspase 3/7 Green Assay (카탈로그 번호 C10432)로 염색된 칵테일로 처리하고, 처리 후에 Incucyte® ZOOM Live-Cell Analysis System으로 0, 24, 48, 72시간에 이미징한 HuVEC 세포. (이미지 출처: Sambi M, Samuel V, Qorri B, Haq S, Burov SV, Markvicheva E, Harless W, Szewczuk MR. A Triple Combination of Metformin, Acetylsalicylic Acid, and Oseltamivir Phosphate Impacts Tumour Spheroid Viability and Upends Chemoresistance in Triple-Negative Breast Cancer. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1995-2019 PMID: 32546966)

예: Live-Cell 이미징 실험에서의 미토콘드리아 활성

Live-Cell 이미징 시약에는 세포 구성 요소를 식별하는 데 사용되는 세포 구조 시약과 세포 기능과 과정을 분석하기 위한 세포 기능 시약이 모두 포함됩니다. 예를 들어, MitoTracker 염료는 Live-Cell의 활성 미토콘드리아에 축적되고 미토콘드리아에 공유 결합되어 미토콘드리아 위치 및 존재비를 평가할 수 있습니다. 반면, TMRMTMRE는 막전위에 따라 미토콘드리아 안팎으로 변동하는 동적인 미토콘드리아 막전위 인디케이터 염료입니다.

Cells stained with MitoTracker Red as indicated with cells with active mitochondria being bright red, the dead cells are stained in green, the nucleus in blue, and imaged with Incucyte® ZOOM Live-Cell Analysis

그림 3. Live-Cell의 활성 미토콘드리아 모니터링.MitoTrackerRed (카탈로그 번호 M22426), Image-iT DEAD Green dyes (카탈로그 번호 I10291), Hoechst (카탈로그 번호 R37165) 로 배양 및 염색하고 Incucyte® ZOOM Live-Cell Analysis System에서 이미징한 환자의 섬유아세포주. (이미지 출처: Smith GA, Jansson J, Rocha EM, Osborn T, Hllett PJ, Isacson O. Fibroblast Biomarkers of Sporadic Parkinson’s Disease and LRRK2 Kinase Inhibition. Mol Neurobiol. 2016 Oct;53(8):5161-77. PMCID: PMC5012155. )


Live-Cell 실험에서 변화를 검출하기 위한 팁

1 단계: 계획

각 단계에 필요한 도구와 리소스를 신중하게 고려하여 실험을 설계하세요.

장점

  • 동적 세포 프로세스가 발생하는 것을 관찰할 수 있습니다.
  • 멀티플렉스 어세이를 사용하여 여러 프로세스와 기능을 동시에 연구하고 이미지화 가능합니다.
  • 원래(native) 환경에서 세포 구조를 연구하여 생체 내(in vivo) 조건에 더 가까운 보다 현실적인 결과를 얻을 수 있습니다.
  • 시간 경과에 따른 세포 생체 분자 및 구조를 추적할 수 있습니다.
  • 세포 간 상호 작용을 관찰할 수 있습니다.
  • 세포 효소 및 기타 세포질 생체 분자를 세포안에서 유지할 수 있습니다.

고려 사항

  • 분자, 세포 기능 또는 세포 상태에 관계없이 최소한의 독성으로 표적을 라벨링하기 위한 구체적인 방법이 있어야 합니다.
  • Live-Cell은 일반적으로 항체와 같은 대형 검출 분자에 투과성이 없습니다.
  • 움직이는 물체는 초점을 유지하기가 더 어려울 수 있습니다.
  • 특정 기술은 Live-Cell에 유해할 수 있습니다.
  • 세포는 자연적인 생리적 상태를 유지해야 합니다.

2 단계: 배양

최적의 조건에서 세포를 유지하거나 성장시켜보세요.

다양한 실험 조작, 검출, 이미징 동안 세포를 살아 있게 하고 건강하게 유지하는 것은 쉬운 작업이 아닙니다. 배지 선택은 세포가 장시간 주변 조건에 노출되는 타임-랩스 이미징 및 실험에 특히 중요합니다. Live-Cell에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 세포가 건강해야 하며 생리적 온도, pH, 산소 수준 및 기타 조건을 최대한 잘 유지해야 합니다.

세포 배양에 대해 자세히 알아보기

주요 제품

이러한 배지 및 세척 버퍼는 Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작되었습니다. 실험에 이 제품을 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

도움말

Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작된 배지 및 세척 버퍼를 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화할 수 있습니다. 제품 선택 가이드 보기

3 단계: 라벨

선택성 염료 및 염색제를 사용하여 관심 있는 세포 구조, 세포 기능, 단백질을 표적으로 할 수 있습니다.

표적 세포 구조 또는 프로세스를 모니터링하려면 적절한 fluorophore(표적 형광 단백질 또는 소형 막 투과 시약)를 사용해야 합니다. 추가적인 fluorophore를 사용하여 여러 세포 구조와 프로세스를 모니터링할 수 있지만, Fluorescence SpectraViewer를 사용하여 excitation 및 emission 스펙트럼을 확인하여 스펙트럼 중복을 최소화해야 합니다. 형광 라벨을 너무 많이 사용하면 다음과 같은 결과가 발생할 수 있으므로 형광 라벨을 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요합니다:

  • 백그라운드 신호가 증가하는 비특이적 염색
  • 생리학적 아티팩트(artifacts) 및 구조적 교란
  • 세포독성
  • 스펙트럼 중첩

참고 사항:

  • Live-Cell 구조 시약 – 세포 구성 요소 식별에 도움을 줍니다.
  • Live-Cell 기능 시약 – 세포 기능 및 프로세스를 식별하는 데 도움을 줍니다.

주요 제품

  • Invitrogen CellLight reagents는 Live-Cell의 특정 구조를 라벨링하는 데 사용하기가 가장 쉬운 것으로 입증되었습니다. 표적 형광 단백질은 Invitrogen BacMam 형질도입 시스템을 사용하여 주입되며 분자 생물학 기술이 필요하지 않습니다. 세포에 시약을 첨가하여 하룻밤 동안 인큐베이션 하면 아침에 이미징이 가능합니다.
  • Invitrogen CellTracker reagents는 형태나 위치의 변화를 확인하기 위해 포유류 세포를 라벨링하는 데 사용되며 다양한 시약 등급으로 제공됩니다. 이 무독성 형광 염료는 세포막을 통해 세포 안으로 자유롭게 통과하여 세포 비침투성 반응 생성물로 변형되도록 설계되었습니다. CellTracker 시약으로 30분 동안 세포를 인큐베이션하면 최소 72시간 동안 형광 신호가 제공됩니다(일반적으로 3~6세대).
  • Invitrogen pHrodo indicators는 주변의 pH가 더욱 산성화됨에 따라 형광이 극적으로 증가하는 형광 염료입니다. pHrodo 염료는 덱스트란, 단백질 또는 기타 입자에 콘주게이트되는 경우, Live-Cell에서 endocytic 및 phagocytic internalization, lysosomal sequestration의 매우 특이적인 센서로 사용될 수 있으며, fluorescein 및 tetramethylrhodamine과 같은 다른 형광 염료 콘주게이트에 대한 탁월한 대안을 제공합니다.

도움말

  • 장시간 광 노출이 필요한 경우 더 긴 파장의 형광 시약 사용을 고려하세요. 이는 더 낮은 excitation 파워를 필요하며, 따라서 광독성을 더 낮추고 세포를 더 건강하게 유지할 수 있습니다.
  • 염색은 특정 어세이 판독, 스펙트럼 호환성 및 신호 대 백그라운드 비율에 맞게 최적화되어야 합니다.
  • 라벨링 용액을 제거하고 신선한 배지로 헹구면 백그라운드 형광이 감소합니다.

4 단계: 최적화

백그라운드를 최소화하고 형광 신호의 광안정성을 유지하세요.

세포외(extracellular) 형광을 줄이고 fluorophore 광안정성을 높이는 시약을 사용하여 신호 대 백그라운드 비율을 최적화할 수 있습니다. Live-Cell 이미징 실험에서 백그라운드 형광을 줄이거나 제거하는 동시에 세포 건강을 유지하기 위해 특별히 설계된 배지에서 이미지를 생성하는 것이 중요합니다(표 1 참조). 또한 Live-Cell과 호환되는 백그라운드 서프레서를 추가하면 세포외(extracellular) 백그라운드 형광을 줄이고 세척 단계가 필요하지 않습니다. Live-Cell을 위한 광퇴색(Antifade) 방지 마운팅 배지(mounting media)를 시료에 적용하여 fluorophore의 광표백을 줄임으로써 다중 노출 또는 장시간 노출로 인한 신호 손실을 방지할 수 있습니다.

표 1. 이미징 배지(media) 비교.

시약세포 세척단시간 이미징최대 4시간 이미징장시간 이미징
Gibco PBS, pH 7.4  
Gibco FluoroBrite DMEM

주요 제품

  • Invitrogen BackDrop Background Suppressor는 청색, 녹색 또는 적색 채널에서 높은 백그라운드 신호 또는 약한 형광을 관찰할 때 사용됩니다.
  • Gibco PBS, pH 7.4는 장시간 인큐베이션이 필요하지 않은 단시간 이미징과 세포 세척에 적합합니다.
  • Invitrogen Live-Cell Imaging Solution은 이미징, 염료 로딩 및 세척 단계에 사용되는 광학적으로 투명한 용액입니다. 최대 4시간 동안 세포를 건강하게 유지할 수 있습니다.
Invitrogen BackDrop Background Suppressor imaging results

Tubulin Tracker Green dyeTubulin Tracker Deep Red dye로 라벨링한 HeLa Live-Cell. 프로브가 염색 용액에 남아 있을 때 두 라벨 모두 높은 세포외 백그라운드를 나타냅니다(왼쪽). BackDrop Background Suppressor를 추가하면 세포내 라벨링에 영향을 주지 않으면서 세포외 백그라운드가 크게 감소하므로(오른쪽), Live-Cell에서 tublin 고대비 이미징을 위한 no-wash 프로토콜이 가능해집니다.

Invitrogen ProLong Live Reagent confocal imaging results

처리되지 않은 시료와 비교한 ProLong Live reagent가 제공하는 전반적인 신호 보호는 처리된 시료와 처리되지 않은 시료가 EC50 값에 도달하는 스캔 수를 기준으로 계산됩니다. Invitrogen CellLight Mitochondria-RFP reagent와 함께 ProLong Live reagent를 추가하면 100% 더 많이 캡처할 수 있습니다.

Invitrogen ProLong Live Reagent fluorescence imaging

표준 타임 랩스(time-lapse) 이미징 프로토콜을 사용하여 120번 노출한 후, ProLong Live reagent로 처리된 시료는 처리되지 않은 세포에 비해 20% 이상 더 밝아 더 많은 데이터 수집 타임이 가능해집니다.

도움말

  • 추가 배양을 계획하지 않는 경우, 백그라운드 서프레서를 사용하여 혼탁을 줄이고 대비를 높여 신호를 최적화할 수 있습니다.
  • 퇴색 방지(antifade) 시약을 사용하면 다양한 시료 유형에서 fluorophore의 광안정성이 증가하고 광독성 효과가 감소하는 것으로 나타났습니다.

5 단계: 이미지

동적 프로세스의 Live-Cell 이미징은 시간 경과에 따른 적극적인 관찰이 필요합니다.

광원 및 검출

광독성을 최소화하려면 광원을 최대한 제어할 수 있는 이미징 시스템을 선택하세요. 낮은 백그라운드로 우수한 신호를 생성하는 동시에, 세포에 가해지는 빛의 강도, 노출 시간, 파장 범위, excitation 에너지의 양을 최소화해보세요. 가장 낮은 수준의 fluorophore excitation로 가장 높은 신호를 제공하는 광원을 사용해보세요. 경우에 따라(특히 장시간 영상을 촬영하고자 할 경우), 더 건강한 세포를 얻기 위해 더 짧은 노출 시간이나 더 낮은 배율을 사용하여 해상도를 희생하는 것이 좋습니다.

장시간에 걸친 Live-Cell 이미징은 실험 과정에서 표적이 초점에서 벗어날 수 있기 때문에 어려운 점이 있습니다. 많은 현미경에는 대상의 초점을 더 오랫동안 유지하고 초점 드리프트를 줄이는 데 도움이 되는 자동 초점 기능이 있습니다. 또한, 세포를 일정한 온도로 유지하고 vessel 내 용액의 부피를 일정하게 유지하면 초점 드리프트에 도움이 됩니다.

환경 제어

많은 세포는 최적의 온도, 삼투압, pH, 습도를 벗어나면 견디기가 어렵습니다. 요구 사항은 실험에 따라 다릅니다. 예를 들어, 세포 성장 및 분열을 조사하는 실험은 수용체 활성화 및 칼슘 축적을 포함한 실험과는 다른 요구 사항을 가질 수 있습니다. 일부 강력한 불멸 세포주는 환경 제어 없이 짧은 시간 동안의 이미지화 또는 모니터링을 견딜 수 있습니다. 그러나, 장시간의 이미징 및 검출 연구에서 불멸 세포와 일차 세포 모두 좋은 결과를 얻기 위해서는 일반적으로 엄격하게 제어되는 환경 매개변수가 필요합니다.

Invitrogen CellTracker Deep Red Dye가 로딩된 HDFn 세포 배양물의 스크래치 손상.(A) 빛이 조사된 영역은 10시간 동안 반복적으로 빛이 조사되었습니다. 이 영역의 세포는 광독성 징후를 보입니다(세포가 손상 부위로 성장해 나갈 수 없어 viability 상실). (B) 빛이 조사되지 않은 영역의 세포는 손상 부위 내로 생존력이 있는 세포 성장을 보여줍니다.

Catastrophic blebbing of the cell membrane

상단의 세포는 과도한 광 노출로 인해 발생하는 세포막의 치명적인 수포형성(blebbing)을 보여줍니다. 수포형성(blebbing)은 독성으로 인한 막 교란을 설명하는 데 사용되는 용어입니다. 반대로, 하단의 세포는 상대적으로 건강한 상태를 유지하며 비정상적인 형태를 나타내지 않습니다.

주요 제품

Countess II FL Automated Cell Counter

실험에서 건강하지 않은 세포를 사용하여 다음 단계를 진행하는 것을 피하기 위해, Countess III FL Automated Cell Counter에서 세포 건강을 빠르게 확인할 수 있으며, 다양한 형광 시약을 함께 사용하면 세포 생존율, 세포사멸, 세포 독성, 트랜스펙션 효율을 검출할 수 있습니다. 재사용 가능한 슬라이드 옵션으로 비용을 절감할 수 있습니다.

Invitrogen EVOS M5000 Imaging System with EVOS Onstage Incubator

Invitrogen EVOS 이미징 시스템용으로 특별히 설계된 Invitrogen EVOS Onstage Incubator는 생리학적, 비생리학적 조건 모두에서 Live-Cell의 타임 랩스(time-lapse) 이미징을 위해 온도, 습도 및 세 가지 가스를 정밀하게 제어할 수 있는 환경 챔버입니다.

CellInsight CX7 LZR High-Content Screening Platform with HCA Onstage Incubator

Thermo Scientific CellInsight HCA 플랫폼Invitrogen HCA Onstage Incubator는 온도, 습도, CO2 농도를 정밀하게 제어할 수 있으므로 시간 경과에 따른 생물학적 활성과 변화를 관찰하고 측정할 수 있습니다. 장시간 이미징 연구에서 수집된 데이터는 정량적 분석 연구의 기반이 되며, 특히 Thermo Scientific HCS Studio Software와 결합하면 통계적인 성능을 향상시킬 수 있습니다.

도움말

  • 단시간 이미징 실험의 경우, 대량의 이미징 배지를 사용하여 배지의 증발로 인한 삼투압 및 산소의 변화를 방지합니다.
  • 시료에 초점을 맞추기 위해 낮은 배율부터 시작하세요. 이렇게 하면 시료가 빛에 노출되는 시간을 최소화할 수 있습니다.
  • 타임 랩스 이미징 중 촬영한 각각의 모든 이미지에 자동 초점 기능을 사용하는 것을 피하세요. 자동 초점은 시료에 닿는 빛 에너지의 양을 최대 10배까지 증가시킬 수 있습니다.
  • 장시간에 걸친 이미징 또는 민감한 세포의 이미징을 위해 이미징 장비에 OSI(onstage incubator)를 추가하여 온도, 습도 및 CO2 수준을 효과적으로 제어할 수 있습니다.

1 단계: 계획

각 단계에 필요한 도구와 리소스를 신중하게 고려하여 실험을 설계하세요.

장점

  • 동적 세포 프로세스가 발생하는 것을 관찰할 수 있습니다.
  • 멀티플렉스 어세이를 사용하여 여러 프로세스와 기능을 동시에 연구하고 이미지화 가능합니다.
  • 원래(native) 환경에서 세포 구조를 연구하여 생체 내(in vivo) 조건에 더 가까운 보다 현실적인 결과를 얻을 수 있습니다.
  • 시간 경과에 따른 세포 생체 분자 및 구조를 추적할 수 있습니다.
  • 세포 간 상호 작용을 관찰할 수 있습니다.
  • 세포 효소 및 기타 세포질 생체 분자를 세포안에서 유지할 수 있습니다.

고려 사항

  • 분자, 세포 기능 또는 세포 상태에 관계없이 최소한의 독성으로 표적을 라벨링하기 위한 구체적인 방법이 있어야 합니다.
  • Live-Cell은 일반적으로 항체와 같은 대형 검출 분자에 투과성이 없습니다.
  • 움직이는 물체는 초점을 유지하기가 더 어려울 수 있습니다.
  • 특정 기술은 Live-Cell에 유해할 수 있습니다.
  • 세포는 자연적인 생리적 상태를 유지해야 합니다.

2 단계: 배양

최적의 조건에서 세포를 유지하거나 성장시켜보세요.

다양한 실험 조작, 검출, 이미징 동안 세포를 살아 있게 하고 건강하게 유지하는 것은 쉬운 작업이 아닙니다. 배지 선택은 세포가 장시간 주변 조건에 노출되는 타임-랩스 이미징 및 실험에 특히 중요합니다. Live-Cell에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 세포가 건강해야 하며 생리적 온도, pH, 산소 수준 및 기타 조건을 최대한 잘 유지해야 합니다.

세포 배양에 대해 자세히 알아보기

주요 제품

이러한 배지 및 세척 버퍼는 Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작되었습니다. 실험에 이 제품을 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

도움말

Live-Cell 이미징 및 검출을 위해 특별히 제작된 배지 및 세척 버퍼를 사용하면 이미지 선명도를 향상시키고 백그라운드 형광을 줄이며 세포 생존율을 최적화할 수 있습니다. 제품 선택 가이드 보기

3 단계: 라벨

선택성 염료 및 염색제를 사용하여 관심 있는 세포 구조, 세포 기능, 단백질을 표적으로 할 수 있습니다.

표적 세포 구조 또는 프로세스를 모니터링하려면 적절한 fluorophore(표적 형광 단백질 또는 소형 막 투과 시약)를 사용해야 합니다. 추가적인 fluorophore를 사용하여 여러 세포 구조와 프로세스를 모니터링할 수 있지만, Fluorescence SpectraViewer를 사용하여 excitation 및 emission 스펙트럼을 확인하여 스펙트럼 중복을 최소화해야 합니다. 형광 라벨을 너무 많이 사용하면 다음과 같은 결과가 발생할 수 있으므로 형광 라벨을 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요합니다:

  • 백그라운드 신호가 증가하는 비특이적 염색
  • 생리학적 아티팩트(artifacts) 및 구조적 교란
  • 세포독성
  • 스펙트럼 중첩

참고 사항:

  • Live-Cell 구조 시약 – 세포 구성 요소 식별에 도움을 줍니다.
  • Live-Cell 기능 시약 – 세포 기능 및 프로세스를 식별하는 데 도움을 줍니다.

주요 제품

  • Invitrogen CellLight reagents는 Live-Cell의 특정 구조를 라벨링하는 데 사용하기가 가장 쉬운 것으로 입증되었습니다. 표적 형광 단백질은 Invitrogen BacMam 형질도입 시스템을 사용하여 주입되며 분자 생물학 기술이 필요하지 않습니다. 세포에 시약을 첨가하여 하룻밤 동안 인큐베이션 하면 아침에 이미징이 가능합니다.
  • Invitrogen CellTracker reagents는 형태나 위치의 변화를 확인하기 위해 포유류 세포를 라벨링하는 데 사용되며 다양한 시약 등급으로 제공됩니다. 이 무독성 형광 염료는 세포막을 통해 세포 안으로 자유롭게 통과하여 세포 비침투성 반응 생성물로 변형되도록 설계되었습니다. CellTracker 시약으로 30분 동안 세포를 인큐베이션하면 최소 72시간 동안 형광 신호가 제공됩니다(일반적으로 3~6세대).
  • Invitrogen pHrodo indicators는 주변의 pH가 더욱 산성화됨에 따라 형광이 극적으로 증가하는 형광 염료입니다. pHrodo 염료는 덱스트란, 단백질 또는 기타 입자에 콘주게이트되는 경우, Live-Cell에서 endocytic 및 phagocytic internalization, lysosomal sequestration의 매우 특이적인 센서로 사용될 수 있으며, fluorescein 및 tetramethylrhodamine과 같은 다른 형광 염료 콘주게이트에 대한 탁월한 대안을 제공합니다.

도움말

  • 장시간 광 노출이 필요한 경우 더 긴 파장의 형광 시약 사용을 고려하세요. 이는 더 낮은 excitation 파워를 필요하며, 따라서 광독성을 더 낮추고 세포를 더 건강하게 유지할 수 있습니다.
  • 염색은 특정 어세이 판독, 스펙트럼 호환성 및 신호 대 백그라운드 비율에 맞게 최적화되어야 합니다.
  • 라벨링 용액을 제거하고 신선한 배지로 헹구면 백그라운드 형광이 감소합니다.

4 단계: 최적화

백그라운드를 최소화하고 형광 신호의 광안정성을 유지하세요.

세포외(extracellular) 형광을 줄이고 fluorophore 광안정성을 높이는 시약을 사용하여 신호 대 백그라운드 비율을 최적화할 수 있습니다. Live-Cell 이미징 실험에서 백그라운드 형광을 줄이거나 제거하는 동시에 세포 건강을 유지하기 위해 특별히 설계된 배지에서 이미지를 생성하는 것이 중요합니다(표 1 참조). 또한 Live-Cell과 호환되는 백그라운드 서프레서를 추가하면 세포외(extracellular) 백그라운드 형광을 줄이고 세척 단계가 필요하지 않습니다. Live-Cell을 위한 광퇴색(Antifade) 방지 마운팅 배지(mounting media)를 시료에 적용하여 fluorophore의 광표백을 줄임으로써 다중 노출 또는 장시간 노출로 인한 신호 손실을 방지할 수 있습니다.

표 1. 이미징 배지(media) 비교.

시약세포 세척단시간 이미징최대 4시간 이미징장시간 이미징
Gibco PBS, pH 7.4  
Gibco FluoroBrite DMEM

주요 제품

  • Invitrogen BackDrop Background Suppressor는 청색, 녹색 또는 적색 채널에서 높은 백그라운드 신호 또는 약한 형광을 관찰할 때 사용됩니다.
  • Gibco PBS, pH 7.4는 장시간 인큐베이션이 필요하지 않은 단시간 이미징과 세포 세척에 적합합니다.
  • Invitrogen Live-Cell Imaging Solution은 이미징, 염료 로딩 및 세척 단계에 사용되는 광학적으로 투명한 용액입니다. 최대 4시간 동안 세포를 건강하게 유지할 수 있습니다.
Invitrogen BackDrop Background Suppressor imaging results

Tubulin Tracker Green dyeTubulin Tracker Deep Red dye로 라벨링한 HeLa Live-Cell. 프로브가 염색 용액에 남아 있을 때 두 라벨 모두 높은 세포외 백그라운드를 나타냅니다(왼쪽). BackDrop Background Suppressor를 추가하면 세포내 라벨링에 영향을 주지 않으면서 세포외 백그라운드가 크게 감소하므로(오른쪽), Live-Cell에서 tublin 고대비 이미징을 위한 no-wash 프로토콜이 가능해집니다.

Invitrogen ProLong Live Reagent confocal imaging results

처리되지 않은 시료와 비교한 ProLong Live reagent가 제공하는 전반적인 신호 보호는 처리된 시료와 처리되지 않은 시료가 EC50 값에 도달하는 스캔 수를 기준으로 계산됩니다. Invitrogen CellLight Mitochondria-RFP reagent와 함께 ProLong Live reagent를 추가하면 100% 더 많이 캡처할 수 있습니다.

Invitrogen ProLong Live Reagent fluorescence imaging

표준 타임 랩스(time-lapse) 이미징 프로토콜을 사용하여 120번 노출한 후, ProLong Live reagent로 처리된 시료는 처리되지 않은 세포에 비해 20% 이상 더 밝아 더 많은 데이터 수집 타임이 가능해집니다.

도움말

  • 추가 배양을 계획하지 않는 경우, 백그라운드 서프레서를 사용하여 혼탁을 줄이고 대비를 높여 신호를 최적화할 수 있습니다.
  • 퇴색 방지(antifade) 시약을 사용하면 다양한 시료 유형에서 fluorophore의 광안정성이 증가하고 광독성 효과가 감소하는 것으로 나타났습니다.

5 단계: 이미지

동적 프로세스의 Live-Cell 이미징은 시간 경과에 따른 적극적인 관찰이 필요합니다.

광원 및 검출

광독성을 최소화하려면 광원을 최대한 제어할 수 있는 이미징 시스템을 선택하세요. 낮은 백그라운드로 우수한 신호를 생성하는 동시에, 세포에 가해지는 빛의 강도, 노출 시간, 파장 범위, excitation 에너지의 양을 최소화해보세요. 가장 낮은 수준의 fluorophore excitation로 가장 높은 신호를 제공하는 광원을 사용해보세요. 경우에 따라(특히 장시간 영상을 촬영하고자 할 경우), 더 건강한 세포를 얻기 위해 더 짧은 노출 시간이나 더 낮은 배율을 사용하여 해상도를 희생하는 것이 좋습니다.

장시간에 걸친 Live-Cell 이미징은 실험 과정에서 표적이 초점에서 벗어날 수 있기 때문에 어려운 점이 있습니다. 많은 현미경에는 대상의 초점을 더 오랫동안 유지하고 초점 드리프트를 줄이는 데 도움이 되는 자동 초점 기능이 있습니다. 또한, 세포를 일정한 온도로 유지하고 vessel 내 용액의 부피를 일정하게 유지하면 초점 드리프트에 도움이 됩니다.

환경 제어

많은 세포는 최적의 온도, 삼투압, pH, 습도를 벗어나면 견디기가 어렵습니다. 요구 사항은 실험에 따라 다릅니다. 예를 들어, 세포 성장 및 분열을 조사하는 실험은 수용체 활성화 및 칼슘 축적을 포함한 실험과는 다른 요구 사항을 가질 수 있습니다. 일부 강력한 불멸 세포주는 환경 제어 없이 짧은 시간 동안의 이미지화 또는 모니터링을 견딜 수 있습니다. 그러나, 장시간의 이미징 및 검출 연구에서 불멸 세포와 일차 세포 모두 좋은 결과를 얻기 위해서는 일반적으로 엄격하게 제어되는 환경 매개변수가 필요합니다.

Invitrogen CellTracker Deep Red Dye가 로딩된 HDFn 세포 배양물의 스크래치 손상.(A) 빛이 조사된 영역은 10시간 동안 반복적으로 빛이 조사되었습니다. 이 영역의 세포는 광독성 징후를 보입니다(세포가 손상 부위로 성장해 나갈 수 없어 viability 상실). (B) 빛이 조사되지 않은 영역의 세포는 손상 부위 내로 생존력이 있는 세포 성장을 보여줍니다.

Catastrophic blebbing of the cell membrane

상단의 세포는 과도한 광 노출로 인해 발생하는 세포막의 치명적인 수포형성(blebbing)을 보여줍니다. 수포형성(blebbing)은 독성으로 인한 막 교란을 설명하는 데 사용되는 용어입니다. 반대로, 하단의 세포는 상대적으로 건강한 상태를 유지하며 비정상적인 형태를 나타내지 않습니다.

주요 제품

Countess II FL Automated Cell Counter

실험에서 건강하지 않은 세포를 사용하여 다음 단계를 진행하는 것을 피하기 위해, Countess III FL Automated Cell Counter에서 세포 건강을 빠르게 확인할 수 있으며, 다양한 형광 시약을 함께 사용하면 세포 생존율, 세포사멸, 세포 독성, 트랜스펙션 효율을 검출할 수 있습니다. 재사용 가능한 슬라이드 옵션으로 비용을 절감할 수 있습니다.

Invitrogen EVOS M5000 Imaging System with EVOS Onstage Incubator

Invitrogen EVOS 이미징 시스템용으로 특별히 설계된 Invitrogen EVOS Onstage Incubator는 생리학적, 비생리학적 조건 모두에서 Live-Cell의 타임 랩스(time-lapse) 이미징을 위해 온도, 습도 및 세 가지 가스를 정밀하게 제어할 수 있는 환경 챔버입니다.

CellInsight CX7 LZR High-Content Screening Platform with HCA Onstage Incubator

Thermo Scientific CellInsight HCA 플랫폼Invitrogen HCA Onstage Incubator는 온도, 습도, CO2 농도를 정밀하게 제어할 수 있으므로 시간 경과에 따른 생물학적 활성과 변화를 관찰하고 측정할 수 있습니다. 장시간 이미징 연구에서 수집된 데이터는 정량적 분석 연구의 기반이 되며, 특히 Thermo Scientific HCS Studio Software와 결합하면 통계적인 성능을 향상시킬 수 있습니다.

도움말

  • 단시간 이미징 실험의 경우, 대량의 이미징 배지를 사용하여 배지의 증발로 인한 삼투압 및 산소의 변화를 방지합니다.
  • 시료에 초점을 맞추기 위해 낮은 배율부터 시작하세요. 이렇게 하면 시료가 빛에 노출되는 시간을 최소화할 수 있습니다.
  • 타임 랩스 이미징 중 촬영한 각각의 모든 이미지에 자동 초점 기능을 사용하는 것을 피하세요. 자동 초점은 시료에 닿는 빛 에너지의 양을 최대 10배까지 증가시킬 수 있습니다.
  • 장시간에 걸친 이미징 또는 민감한 세포의 이미징을 위해 이미징 장비에 OSI(onstage incubator)를 추가하여 온도, 습도 및 CO2 수준을 효과적으로 제어할 수 있습니다.

주요 웨비나

모범 사례: Live-Cell 이미징을 위한 5 단계

이 웨비나에서는 Live-Cell 이미징에 초보이든 숙련된 연구자이든 관계없이 시간과 자원 낭비로 인한 좌절을 피하면서 항상 고품질의 Live-Cell 이미지를 얻을 수 있는 방법을 보여드립니다.

Live-Cell 이미지 및 동영상의 예

Live-Cell 이미징 동영상 갤러리

Live-Cell 이미징 리소스

추가 정보 및 데이터는 다음 포스터를 참조하세요.

포스터: Live-Cell 현미경 검사에서 카스파제(caspase) 활성화 및 미토콘드리아 초산화물을 위한 차세대 센서
포스터: 마이크로플레이트 리더 검사를 사용한 2D 및 3D 세포 모델의 새롭고 향상된 세포 건강 평가
포스터: 형광 현미경 검사와 high-content 이미징을 사용한 live cell 및 fixed cell의 저산소증 측정
포스터: 형광 특성 분석을 통한 세포 노화 평가

*Incucyte ® Live-Cell Analysis System은 Essen BioScience의 상표 또는 등록 상표입니다. Incucyte, Essen BioScience 및 Essen BioScience의 모든 제품명은 별도로 명시되지 않는 한 Essen BioScience의 등록 상표 및 재산입니다. Essen BioScience는 Sartorius Company입니다. MuviCyte™ Live-Cell 이미징 시스템은 PerkinElmer의 상표 또는 등록 상표입니다. THUNDER Imager Live-Cell & 3D Assay 및 MICA Microhub Microscope는 Leica Microsystems CMS GmbH에서 판매합니다.

 

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