Datos de muestras Bigfoot Spectral Cell Sorter

Los datos de rendimiento muestran que el clasificador de células espectrales Bigfoot resuelve las señales fluorescentes de forma precisa y exacta. Los datos de aplicación muestran el nivel de resolución de sincronización y pureza de clasificación necesarios para los estudios de inmunofenotipado y expresión de marcadores.

Para obtener datos de aplicación adicionales, descargue las notas de aplicación que figuran en esta sección y en la página Recursos.

Las microesferas de 8 picos Spherotech™ que se ejecutan en canales clave en el clasificador de células espectrales Bigfoot muestran picos estrechos y bien definidos.

Se ha observado en estudios recientes que diferentes miembros de la familia de receptores de lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (Siglec) se expresan mediante diferentes leucocitos en diversas etapas de desarrollo y activación. Las interacciones entre el ácido siálico y las Siglec son inmunosupresoras y ayudan a las células inmunitarias a distinguir entre sí mismas y las distintas, ya que los microrganismos patógenos a menudo carecen de ácidos siálicos.

En este experimento, los investigadores del Instituto de Investigación Scripps utilizaron un clasificador de células espectrales de Bigfoot con 5 láseres para explorar de qué modo los receptores de Siglec se expresan mediante diferentes subconjuntos de leucocitos aislados de células esplénicas murinas. Los subconjuntos de leucocitos principales se clasificaron en función de esas asociaciones.

Utilizando las herramientas de diseño de paneles del software Sasquatch, como el gráfico de firmas espectrales y el cálculo de complejidad, los investigadores diseñaron un panel espectral de 23 colores con 15 colores para inmunofenotipado, siete para marcadores de Siglec y uno para discriminación entre células vivas y muertas. El análisis espectral ofreció opciones adicionales de fluoróforos que no hubieran sido posibles mediante la compensación convencional, como la combinación de FITC y Alexa Fluor 532 en el mismo panel. Todos los reactivos estaban disponibles para la venta de una amplia gama de fabricantes.

La figura muestra ejemplos de estrategia y análisis de sincronización (descritos completamente en nuestro documento técnico). A la izquierda, se identificaron monocitos y macrófagos mediante las expresiones CD11b, F4/80 y Ly6c. A la derecha, se utilizó Siglec-F en combinación con CD11c y Ly6G para identificar células dendríticas (CD11c⁺siglec-F^-), eosinófilos (CD11c^-siglec-F⁺) y neutrófilos (CD11c^-siglec-F^-Ly6G⁺). La expresión de Siglec se correspondió con patrones esperados de experimentos previos.

Al utilizar las regiones de sincronización, los investigadores clasificaron seis poblaciones: linfocitos T CD4 y CD8, linfocitos B, linfocitos NK, células dendríticas y neutrófilos. Para verificarlo, hicieron comprobaciones de clasificación de los tubos de recogida en un analizador espectral de 5 láseres independiente fabricado por un competidor. La figura muestra que las cuatro poblaciones principales alcanzaron una pureza del 96 % o superior. Las células dendríticas y los neutrófilos también se clasificaron correctamente, pero no se pudieron mostrar debido a poblaciones de células pequeñas o problemas de viabilidad no relacionados con la clasificación.

Este experimento muestra el inmunofenotipado de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en un clasificador de células espectrales Bigfoot con 5 láseres. Hemos diseñado un panel espectral de 15 colores para diferenciar y clasificar los principales tipos de células sanguíneas y mostrar la expresión de marcadores clave.

La figura muestra ejemplos de estrategia y análisis de sincronización (descritos completamente en nuestro documento técnico). El panel A muestra la selección de clasificación de los linfocitos T reguladores raros (Tregs), mientras que los paneles B y C muestran patrones de perfiles de expresión de CD45RA, CD45RO y TCRγδ.

Utilizando las regiones de clasificación seleccionadas como la selección Treg anterior, se clasificaron seis poblaciones: Linfocitos T CD8⁺ y citotóxicos, linfocitos B, linfocitos NK, monocitos y Tregs. Para la verificación posterior a la clasificación, cada tubo de recogida se volvió a analizar para calibrar su pureza. El análisis de las poblaciones de clasificación (cuatro de las cuales se muestran en la figura) mostró que la capacidad de desmezclado espectral del clasificador de células espectrales Bigfoot produjo resultados con una alta eficiencia y más del 98 % de pureza. Este rendimiento en la clasificación es equivalente a los clasificadores que utilizan la compensación tradicional, lo que permite a los usuarios realizar una transición sin problemas entre los dos métodos a medida que aumenta la complejidad experimental.

Aunque la polarización es una propiedad de la luz láser que se suele ignorar en la citometría de flujo, puede ser útil para diferenciar determinados tipos de células. Por ejemplo, los granulocitos de eosinófilos en sangre humana muestran niveles relativamente más altos de luz láser despolarizada en un detector de dispersión lateral (SSC) debido a sus propiedades birrefringentes. El análisis de la polarización también ha sido útil en el diagnóstico de la malaria y en los estudios de fitoplancton marino.

Todos los modelos del clasificador de células Bigfoot incluyen detectores adicionales FSC (dispersión frontal) y SSC para la detección de luz despolarizada. La figura muestra el uso del detector despolarizado SSC para identificar eosinófilos en sangre completa humana lisada. Esta diferenciación no requiere tinción, de modo que no se alteran las células y se ahorra dinero en fluoróforos. Al añadir una tinción para CD16, también se pueden identificar otras poblaciones celulares.