Countess自動細胞計數儀的性能和應用數據。

根據性能數據顯示，Countess 3細胞計數儀對於絕大部分的細胞類型和各種挑戰，皆能進行準確又精密的計數。應用數據顯示了研究人員在細胞活性、細胞凋亡、轉染效率、CAR-T細胞培養、CRISPR轉導等研究中可以得到符合預期的產出。

 

有關更多應用數據，請於本頁和資源頁面下載應用指南。

 

本段中的一些數據取材自Countess II儀器。我們預期Countess 3儀器的等效數據將與Countess II一樣好或著更佳。

細胞計數準確度和精密度

機器學習演算法（machine-learning algorithm）實現了高準確度的細胞計數，可媲美流式細胞儀。

使用Attune NxT流式細胞儀（紫色長條圖）、Countess 3 FL自動細胞計數儀（紅色長條圖）以及血球計數器和顯微鏡（手動計數，灰色長條圖）對CHO-K1、HeLa、HEK293、Jurkat和人類PBMC（涵蓋各種大小）進行了計數。Countess 3 FL細胞計數儀和血球計數器的長條圖代表6次獨立計數的平均值且其高度一致。手動計數擁有比Countess 3計數或流式細胞儀更寬的誤差線（計數標準差）。

機器學習演算法可實現高度準確和精密的細胞計數，且其變異性低於手動計數。

使用Countess 3 FL自動細胞計數儀（深藍點）以及手動使用血球計數器與顯微鏡（淺綠點），對CHO-K1、HeLa、HEK293、Jurkat和人類PBMC（涵蓋各種大小）進行了計數。Countess 3和血球計數器兩者的計數中位數（短水平線）相似，但單獨觀察血球計數器的計數（點）顯示出更大的變異度—使用者間的差異超過20%。

深具挑戰的細胞類型

機器學習演算法對於具挑戰性的細胞類型可實現高準確度的細胞計數，並且比手動計數的精密度更佳。

 

使用Countess 3 FL自動細胞計數器（藍色長條圖），以及手動使用血球計數器與顯微鏡（綠色長條圖）對人類和齧齒動物的外周邊血單核細胞（PBMCs）進行計數（上圖），這些細胞因其體積小和對比度低，造成計數難度極高。所有長條圖代表六次計數。誤差線表示標準差，可觀察到手動計數的標準差顯著較大。影像中（下圖）顯示了被鑑定出並計數的人類（左圖）與鼠亞科動物（右圖）的PBMC。

成團細胞

機器學習演算法可對成團細胞和樣品碎片進行準確計數。

 

使用Countess 3 FL自動細胞計數儀，在明視野模式下針對RAW細胞（小鼠巨噬細胞）進行計數，這些細胞體積微小且容易成團。Trypan blue染色用於確定細胞活性。該圖顯示了原始圖像（左圖）和增強後圖像（右圖），其中活細胞為綠色輪廓，死細胞則為紅色輪廓。計數演算法可辨識出團塊中的細胞，正確區分並加以計數。被辨識的碎片會在計數時自動排除。

細胞活性

小鼠PBMC在明視野和螢光模式下的細胞活性。

 

使用Countess 3和Countess 3 FL自動細胞計數儀，在明視野和螢光模式下對於小至5 µm的小鼠PBMC進行計數。在明視野計數中（左圖），使用trypan blue染劑（0.4 %）來區分細胞活性。Countess 3細胞計數儀用綠色輪廓（圓圈）圈出活（半透明）細胞，用紅色輪廓圈出死（染為深色）細胞，由此區分它們的活性。

 

在螢光模式下（右圖），吖啶橙acridine orange和碘化丙啶propidium iodide (AO/PI)測定對於活/死細胞狀態具有更高的特異性。AO將全部有核活細胞染成綠色，可使用EVOS GFP 2.0光源模組進行檢測；而PI將死細胞染成紅色，可使用EVOS Texas Red 2.0光源模組進行檢測。由此說明螢光染色是比trypan blue更為準確的細胞活性測定的實例之一。

細胞凋亡

螢光模式下的凋亡和死細胞檢測。

在使用2 µM和4 µM staurosporine培養後，USO2（人骨肉瘤上皮）細胞以1:400 CellEvent Caspase-3/7 Green檢測試劑標記以辨識凋亡細胞，然後用1:1,000 SYTOX Red死細胞染劑以標示所有死細胞。細胞在室溫下培養30分鐘，然後以配載EVOS LED GFP 2.0和Cy5 2.0光源模組的Countess 3 FL自動細胞計數儀進行計數。綠色和遠紅色信號的強度均隨著藥物劑量的增加而增強，這分別表示細胞凋亡和細胞死亡都顯著增加。4 µL staurosporine的百分比總和超過100%，是因為這三個類別中皆有計數同時表達兩種染劑（GFP+CY5）之16%細胞。

Precise single cell counting and viability assessment with Countess

Explore our latest application note focusing on the counting of single cells and nuclei for scRNA-Seq and scATAC-Seq.  Enhance your research with precise cell counting and viability assessment. 

 

Single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) and single-cell sequencing assay for transposase-accessible chromatin (scATAC-Seq) technologies enable new insights into gene expression and regulation by providing data resolution at the single-cell level. To obtain high-quality single-cell data, protocols for scRNA-Seq and scATAC-Seq require an accurate count of viable suspended single cells or nuclei as input, with minimal presence of cellular aggregates and dead cells. The Invitrogen Countess 3 FL Automated Cell Counter is a dependable solution for accurately counting cells and nuclei, evaluating their viability, and assessing aggregation. To help ensure optimal performance of the Countess 3 FL cell counter in such protocols, this application note provides a best practices guide.

Accurate and automated counting of single cells and nuclei for scRNA-Seq and scATAC-Seq. 

 

Counting of nuclei on the Countess 3 FL Automated Cell Counter using FL-based counting resulted in accurate counts, verified via sequencing. FL-based counts of nuclei isolated from the GM12878 cell line (A) and PBMCs (B) counted more nuclei than BF-based or Countess II instrument counts. (C) Isolation of nuclei from brain tissue produced accurate FL-based counts, comparable to counts from the Cellaca™ MX High-Throughput Automated Cell Counter. (D) Next-generation sequencing (NGS) confirmed accurate loading of 2,000 target nuclei, obtained from FL-based counts. *FL-based counts available on Countess 3 FL instrument using software update 3. Data obtained by 10x Genomics R&D.

轉染效率

透過Countess 3 FL自動細胞計數儀，您可以在執行下游實驗和分析之前，快速驗證細胞成功轉染或轉導的比例。

在螢光模式下進行轉染效率定量。

以GFP表達載體進行Jurkat細胞的轉染。以EVOS M5000影像系統拍攝的圖像（左下）中，可清晰看到細胞黏附在血管上（左上）。細胞以胰蛋白酶解離後，在配備EVOS LED GFP光源模組的Countess 3 FL細胞計數儀進行計數。分析結果顯示，有50%的細胞成功轉染。可以根據亮度對細胞進行gating（中上），以從最終計數中排除亮度微弱區域的細胞（低GFP表達）（右上）。

透過流式細胞儀與自動細胞計數測量轉導效率。

 

使用Invitrogen CellLight Nucleus-GFP、BacMam 2.0對U2OS細胞進行了轉導，之後培養36小時。透過流式細胞術（左圖）和配備GFP光源模組的Countess II FL自動細胞計數儀（右圖），對細胞的螢光蛋白表達進行評估。兩種方法測定出的轉導率幾乎完全相同—分別為49.5%及49%。

CAR-T細胞擴增過程中的細胞培養品質控管

當擴增T細胞以研究或發展新型免疫療法（如CAR-T）時，至關重要的是透過少量細胞樣品即可快速評估T細胞的健康狀況，以確保細胞已達最佳活性。Countess 3 FL自動細胞計數儀可以在細胞分離和活化前後，快速且準確地測定細胞活性和濃度，為未來的實驗節省寶貴的時間及細胞。

CARA-T細胞培養品質控管

 

使用Dynabeads Untouched Human T細胞試劑盒進行CAR-T細胞分離，並使用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28進行T細胞的擴增和活化。透過trypan blue染色在Countess 3 FL自動細胞計數儀上進行明視野計數，在擴增前後監控細胞培養。在細胞影像（左）和長條圖（右）中，T細胞和微珠自動被區分，T細胞顯示為活細胞（綠色），而微珠顯示為死細胞（紅色）。如果需要，也可以根據尺寸大小和強度手動對微珠進行gating。

CRISPR-Cas9轉導細胞的活性和轉導效率

在使用CRISPR-Cas9進行基因組編輯工程中，慢病毒轉導通常用於將CRISPR-Cas9複合體有效地遞送入細胞。表達螢光蛋白（如GFP）的對照物以及可能敲除的其他基因（如HPRT），經常用於測量轉導效率。Countess 3 FL自動細胞計數儀可同時對這些細胞的活性和轉導效率進行定量。

透過GFP表達以測定慢病毒轉導效率。

 

表達Cas9蛋白的U2OS細胞，透過LentiArray CRISPR陽性對照慢病毒、人類HPRT、GFP和陰性對照慢病毒 (scramble, GFP)，依感染複數(MOI)1和2進行轉導。兩天後，以Countess II FL細胞計數儀對表達GFP的細胞進行計數。Countess II FL儀器上顯示出典型的計數結果（左圖）。長條圖顯示GFP陽性細胞的百分比（右圖），代表轉導十分成功。

流式細胞術和細胞分選的樣品與染色驗證

許多流式細胞術與細胞分選方案，都推薦使用特定的細胞濃度或範圍，以實現最佳染色和分析。在流式細胞術或螢光輔助細胞分選（FACS）之前，透過Countess 3自動細胞計數儀進行初步篩選，可提高實驗成功率，並可能省下寶貴的時間、花費與樣品。您可以快速驗證以下 (a) 您是否有足夠的細胞以完成方案，(b) 您使用了最佳數量的染劑，(c) 在染色期間您沒有損失大量細胞，以及 (d) 您的細胞已得到有效染色或轉導。

細胞濃度對流式細胞術之細胞週期分析的影響。

不同濃度的Jurkat活細胞以固定濃度(10μM)的Vybrant DyeCycle Orange染劑來進行標記，這是一種細胞滲透性染劑，與DNA結合時會發出螢光，並在達最佳染色時形成"椅狀"的細胞週期長條圖。相同濃度的染劑在低細胞濃度（左圖）和高細胞濃度（右圖）都會產生不佳的細胞週期長條圖，而使用最佳細胞濃度（1 x 106個細胞/mL）進行染色則產生正確的細胞週期長條圖（中心）。透過配備EVOS LED RFP 2.0光源模組的Countess 3 FL自動細胞計數儀，可輕鬆快速地對染色長條圖進行驗證。

僅供研究用途，不得用於診斷程序。