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等温扩增酶
关键样本的可靠扩增
等温扩增是在恒定温度下进行核酸指数扩增的可靠方法，无需进行热循环。其为扩增有限 DNA 样本量的理想技术，其灵敏度等于或高于基准常规 PCR 方法。核酸等温扩增方法在血液筛查、传染病诊断、癌症研究等方面的应用持续不断增长。
RT-LAMP protocol and application note for fast and simple RNA-based amplification of viral pathogens, including of SARS-CoV-2
Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) is an easy method for RNA-based amplification of viral pathogens. The RT-LAMP protocol includes reagents for fast and simple testing and surveillance of viral pathogens, including SARS-CoV-2. The workflow is easy to set-up, with a fast turnaround time, and only requires a simple heat source to maintain a constant temperature. A positive RT-LAMP reaction can be visualized by several methods (e.g. change in color and via agarose gel electrophoresis).
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等温扩增相对于常规 PCR 的优势
- 成本低，无需扩增设备
- 减少污染概率
- 对反应抑制剂的敏感性较低
- 可用于即时检验（POCT）
EquiPhi29 和 Bsm DNA 聚合酶可在环介导等温扩增 (LAMP) 和全基因组扩增 (WGA) 两种主要应用中进行灵敏可靠的等温扩增。
LAMP 是一种粗犷的、低成本的方法，用于特定的 DNA 检测，并具有可视化读数。特别适用于在野外快速诊断植物病原体或传染病原体。
LAMP 使用六种引物（相比 PCR 只使用了两种），使您可以将多个基因组序列区域作为特异性靶标（图1）。在等温条件下，DNA 合成起点数量的增加可提供更高的特异性和灵敏度。随着合成的开始，成对的引物形成环以促进每一轮扩增。
图 1.LAMP 反应引物设计。
通常用于 LAMP 的酶是 Bsm DNA 聚合酶，其为 Bacillus smithii DNA 聚合酶的一部分，相当于 Bst DNA 聚合酶大片段。 它具有很强的链置换活性，最适温度为 60°C。Bsm DNA 聚合酶的扩增非常有效，可在短短15 分钟内复制 10 亿倍的 DNA 靶标。该酶对复杂样品中的抑制剂有很强的抵抗能力，所以植物组织、血液、尿液或唾液只需简单处理即可进行检测。
想要增加样本量有限的 DNA 靶标，等温全基因组扩增 (WGA) 是最有效的方法。[1] 特别是在需要多次重复实验的遗传疾病研究中特别有用。通过 WGA 扩增的 DNA 可以用于下游的二代测序、Sanger 测序、芯片基因分型和单核苷酸多态性 (SNP) 基因分型。[2] 目前已经开发出了多种 WGA 技术，它们的操作方法和易用性各不相同。
Phi29 DNA 聚合酶是进行 WGA 的首选酶。Thermo Scientific 可提供一种 改进型 EquiPhi 29 DNA 聚合酶，其是通过体外蛋白改造而开发的特殊 Phi29 DNA 聚合酶突变体。[3] 该酶在蛋白热稳定性、反应速度、产物产率和扩增偏好性方面明显优于常规 Phi29。此外，它保留了野生型酶的所有优点，包括高持续合成能力（扩增长达 70 kb）、强劲的链置换活性和 3'→5' 核酸外切酶（校正）活性。因此，推荐使用 exo-resistant random primer。表 1中将经典 Phi29 和EquiPhi 29 DNA 聚合酶做了比较。
表 1.Phi29 和 EquiPhi29 DNA 聚合酶相关数据比较。
| Phi29-类 DNA 聚合酶 | EquiPhi29 DNA 聚合酶 | |
|---|---|---|
| 持续合成能力 / 链置换活性 | 高（长达70kb） | 高（长达70kb） |
| 最佳扩增温度 | 30-37 °C | 42-45 °C |
| 反应时间 | 慢 – 长达 12h | 慢 – 长达 3h |
| 校正活性 | 3′→5′ (低错误率) | 3′→5′ (低错误率) |
| 准确度 | 高（低错误率） | 高（低错误率） |
| 产量 | 高 | 非常高 |
| 序列偏好性 | 低偏好性、长片段（整个基因组）均匀扩增 | 极低偏好性，包括高 GC 和 AT 含量模板（数据适用于0.5 ng 的起始材料） |
与其它 WGA 商业化试剂相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶还可以实现时间更短、速度更快的多重置换扩增 (MDA) 方案。 动手操作时间大约 30 分钟，整个流程时间大约是 2 个小时（图2）。
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图 2.使用 EquiPhi29 DNA 聚合酶进行多重置换扩增 (MDA) 的反应体系配制。
EquiPhi29 DNA 聚合酶
在与其它同类 Phi29 DNA 聚合酶的研究中，EquiPhi29 DNA 聚合酶在扩增高 GC 含量靶标时偏好性最低（图1），并且无论是从 DNA 质粒（图3）还是从整个基因组DNA（图4），均可在 2 小时内扩增获得最高产量的靶序列。
图 3.当扩增3细菌基因组时，EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出较低的 GC 偏好性。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及来自另一个供应商的 DNA 聚合酶，扩增具有低 GC 含量（S. aureus，33％GC）、中等 GC 含量（E. coli，51％GC）和高 GC 含量（P. aeruginosa，68％GC）细菌基因组的混合物。对于每个基因组，参考基因组的 GC 含量（以 100 bp windows 表示，灰色）被转换成未扩增基因组混合物的归一化的覆盖率（绿色）。在没有序列偏好性的情况下，所有 windows 应均匀分布且归一化覆盖度接近 1，以浅蓝色表示。使用不同聚合酶扩增后得到的归一化覆盖率。与其它 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶在所有 GC 含量范围内均可以最低的 GC 偏好性扩增 DNA（EquiPhi29 DNA 聚合酶以黄色表示）。
图 4.与其它供应商的产品相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶可以更快的速度获得更高产量的基因组DNA。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及其它供应商的 DNA 聚合酶，扩增 0.5 ng 的人类基因组DNA。使用磁珠纯化 DNA 产物，并使用 Qubit dsDNA BR Assay Kit 定量分析 DNA 产物。EquiPhi29 DNA 聚合酶的推荐反应温度为 42°C；但是，在 30°C 下孵育 4 小时，可以获得更高的产量。
相关文献
- Zhang L et al.(1992) Whole genome amplification from a single cell: Implications for genetic analysis. PNAS 89(13):5847-51.
- Dean FB et al.(2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. PNAS 99(8):5261-6.
- Povilaitis T et al.(2016) In vitro evolution of phi29 DNA polymerase using isothermal compartmentalized self replication technique. Protein Eng Des Sel 29(12):617-628.
LAMP 是一种粗犷的、低成本的方法，用于特定的 DNA 检测，并具有可视化读数。特别适用于在野外快速诊断植物病原体或传染病原体。
LAMP 使用六种引物（相比 PCR 只使用了两种），使您可以将多个基因组序列区域作为特异性靶标（图1）。在等温条件下，DNA 合成起点数量的增加可提供更高的特异性和灵敏度。随着合成的开始，成对的引物形成环以促进每一轮扩增。
图 1.LAMP 反应引物设计。
通常用于 LAMP 的酶是 Bsm DNA 聚合酶，其为 Bacillus smithii DNA 聚合酶的一部分，相当于 Bst DNA 聚合酶大片段。 它具有很强的链置换活性，最适温度为 60°C。Bsm DNA 聚合酶的扩增非常有效，可在短短15 分钟内复制 10 亿倍的 DNA 靶标。该酶对复杂样品中的抑制剂有很强的抵抗能力，所以植物组织、血液、尿液或唾液只需简单处理即可进行检测。
想要增加样本量有限的 DNA 靶标，等温全基因组扩增 (WGA) 是最有效的方法。[1] 特别是在需要多次重复实验的遗传疾病研究中特别有用。通过 WGA 扩增的 DNA 可以用于下游的二代测序、Sanger 测序、芯片基因分型和单核苷酸多态性 (SNP) 基因分型。[2] 目前已经开发出了多种 WGA 技术，它们的操作方法和易用性各不相同。
Phi29 DNA 聚合酶是进行 WGA 的首选酶。Thermo Scientific 可提供一种 改进型 EquiPhi 29 DNA 聚合酶，其是通过体外蛋白改造而开发的特殊 Phi29 DNA 聚合酶突变体。[3] 该酶在蛋白热稳定性、反应速度、产物产率和扩增偏好性方面明显优于常规 Phi29。此外，它保留了野生型酶的所有优点，包括高持续合成能力（扩增长达 70 kb）、强劲的链置换活性和 3'→5' 核酸外切酶（校正）活性。因此，推荐使用 exo-resistant random primer。表 1中将经典 Phi29 和EquiPhi 29 DNA 聚合酶做了比较。
表 1.Phi29 和 EquiPhi29 DNA 聚合酶相关数据比较。
| Phi29-类 DNA 聚合酶 | EquiPhi29 DNA 聚合酶 | |
|---|---|---|
| 持续合成能力 / 链置换活性 | 高（长达70kb） | 高（长达70kb） |
| 最佳扩增温度 | 30-37 °C | 42-45 °C |
| 反应时间 | 慢 – 长达 12h | 慢 – 长达 3h |
| 校正活性 | 3′→5′ (低错误率) | 3′→5′ (低错误率) |
| 准确度 | 高（低错误率） | 高（低错误率） |
| 产量 | 高 | 非常高 |
| 序列偏好性 | 低偏好性、长片段（整个基因组）均匀扩增 | 极低偏好性，包括高 GC 和 AT 含量模板（数据适用于0.5 ng 的起始材料） |
与其它 WGA 商业化试剂相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶还可以实现时间更短、速度更快的多重置换扩增 (MDA) 方案。 动手操作时间大约 30 分钟，整个流程时间大约是 2 个小时（图2）。
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图 2.使用 EquiPhi29 DNA 聚合酶进行多重置换扩增 (MDA) 的反应体系配制。
EquiPhi29 DNA 聚合酶
在与其它同类 Phi29 DNA 聚合酶的研究中，EquiPhi29 DNA 聚合酶在扩增高 GC 含量靶标时偏好性最低（图1），并且无论是从 DNA 质粒（图3）还是从整个基因组DNA（图4），均可在 2 小时内扩增获得最高产量的靶序列。
图 3.当扩增3细菌基因组时，EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出较低的 GC 偏好性。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及来自另一个供应商的 DNA 聚合酶，扩增具有低 GC 含量（S. aureus，33％GC）、中等 GC 含量（E. coli，51％GC）和高 GC 含量（P. aeruginosa，68％GC）细菌基因组的混合物。对于每个基因组，参考基因组的 GC 含量（以 100 bp windows 表示，灰色）被转换成未扩增基因组混合物的归一化的覆盖率（绿色）。在没有序列偏好性的情况下，所有 windows 应均匀分布且归一化覆盖度接近 1，以浅蓝色表示。使用不同聚合酶扩增后得到的归一化覆盖率。与其它 DNA 聚合酶相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶在所有 GC 含量范围内均可以最低的 GC 偏好性扩增 DNA（EquiPhi29 DNA 聚合酶以黄色表示）。
图 4.与其它供应商的产品相比，EquiPhi29 DNA 聚合酶可以更快的速度获得更高产量的基因组DNA。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及其它供应商的 DNA 聚合酶，扩增 0.5 ng 的人类基因组DNA。使用磁珠纯化 DNA 产物，并使用 Qubit dsDNA BR Assay Kit 定量分析 DNA 产物。EquiPhi29 DNA 聚合酶的推荐反应温度为 42°C；但是，在 30°C 下孵育 4 小时，可以获得更高的产量。
相关文献
- Zhang L et al.(1992) Whole genome amplification from a single cell: Implications for genetic analysis. PNAS 89(13):5847-51.
- Dean FB et al.(2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. PNAS 99(8):5261-6.
- Povilaitis T et al.(2016) In vitro evolution of phi29 DNA polymerase using isothermal compartmentalized self replication technique. Protein Eng Des Sel 29(12):617-628.
