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GeneBLAzer β-内酰胺酶报告基因技术可为您提供较可靠的集成工具集,用于在药物发现中加速基于细胞的靶标校验、通路分析和化合物筛选。
这种经过验证的技术结合了分子和细胞生物学以及基于荧光共振能量转移 (FRET) 的比率检测法,可以降低可能导致假匹配的实验噪声。
GeneBLAzer 技术由易于获取的工具和定制检测方案组成(点击下表),可用于研究众多靶标类别和细胞过程,包括:表面和细胞内报告基因(例如核和细胞因子受体、孤儿受体和已知的 G 蛋白偶联受体)、广泛的信号转导通路、离子通道、其他转运蛋白和转录调控因子(包括激酶和细胞内过程)。
采用 GeneBLAzer 报告基因技术的集成解决方案
GeneBLAzer 技术将一种针对哺乳动物优化的 bla 基因与支持 FRET 的底物相结合,可在细胞中进行可靠且灵敏的检测。
细胞中装载含两种荧光探针(香豆素和荧光素)的工程荧光底物。在没有 bla 表达的情况下,则底物分子将保持完整。在此状态下,香豆素激发导致荧光共振能量转移至荧光素部分并发射绿光。然而,若存在 bla 表达,则底物被切割,导致荧光基团分离且能量转移受到破坏。bla 酶活性存在时,香豆素的激发会产生蓝色荧光信号。所得的蓝:绿比率提供了标准化的报告基因响应。
为比较某些类型的实验噪声对比率式和非比率式报告基因读数的影响,使用包括细胞数量和底物浓度变化的检测条件生成数据。将组成型表达 β-内酰胺酶的细胞以不同融合程度铺板,并添加推荐浓度 (1X) 或高浓度 (4X) 的 LiveBLAzer-FRET B/G 底物。
使用编码 G 蛋白偶联受体的 cDNA 稳定转染表达与环状 AMP 反应元件 (CRE) 偶联的 β-内酰胺酶的 HEK 293T 细胞。然后用浓度递增的多种激动剂处理细胞,并使用 LiveBlazer-FRET B/G 底物进行分析。数据显示,即使在差异很小的情况下,GeneBLAzer 技术也能够确定效力排序并区分激动类型。所示的剂量反应曲线涵盖完全激动剂(化合物1和2)、部分激动剂(化合物3和4)和反向激动剂(化合物5)。
通过 Fluo-4 与 LiveBLAzer-FRET B/G 多通路检测,使用 LOPAC 12080TM 小分子文库以激动剂模式分析 5HT1a-G_NFAT-bla CHO-K1 细胞。在细胞中加入 Fluo-4 以寻找与血清素受体结合后触发 Ca2+ 通量的化合物。在相同的细胞中加入 LiveBLAzer-FRET B/G 底物,然后进行分析。使用 Fluo-4 的结果见图1,使用 LiveBLAzer-FRET B/G 的结果见图2。
在通过 LiveBLAzer 检测法检出的18种已知血清素受体激动剂中,有16种也经 Fluo-4 检测法检出。相比之下,其他4种经 LiveBLAzer 检测法检出的化合物在 Fluo-4 检测中未被检出,而经 Fluo-4 检测法检出的额外6种化合物在 LiveBLAzer 检测中未被检出。通过使用这两种检测技术进行多通路检测,可对真实匹配进行校验,同时消除非真实匹配。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。