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Viewing cells with white light only allows you to see so much. By selectively labeling proteins, structures, and biological processes with fluorescent proteins, dyes or conjugated antibodies, what you can observe and track increases dramatically.
Learn about what characteristics of fluorescent dyes are important and see how they can be used in functional and structural cell analysis studies.
更清楚地观察细胞结构和蛋白使用白光观察细胞,可观察到的信息毕竟有限。通过荧光蛋白、染料或者偶联抗体选择性地标记蛋白、细胞结构和生物过程,可观察和追踪的信息显著增加。 您可在本节了解一些重要的荧光染料特性,及它们如何用于细胞功能和结构分析研究。 |
相比单独使用明场显微镜观察样品,使用荧光显微镜可以提供更好的对比度。使用不同的荧光颜色标记各种不同靶标,您可以同一实验、同一个细胞中观察到不同的蛋白和结构。荧光标记靶标的方法包括荧光染料、免疫标记, 和 荧光融合蛋白法—所有这些方法都可以选择性的标记细胞结构和细胞内蛋白,让您能更轻松地观察到它们的成像图像。
有些染料可用于活细胞, 而有些染料则适用于 固定和透化细胞. 与任何技术一样,用荧光染料标记靶标目标也有一定的局限性。当荧光染料用于标记活细胞时,它们可能是具有 光毒性的. 有时可能无法找到可准确标记出您希望观察到的靶标的荧光染料。如果没有可用的荧光染料,您可以尝试对固定细胞进行免疫标记 或者对固定或活细胞内的 荧光融合蛋白 进行检测。
Many fluorescent tools for cell biology are essentially fluorophores that have been modified in different ways or conjugated to various molecules to give them a certain function or allow them to bind to specific organelles or proteins.
Through chemical modifications, a single fluorophore can be produced in a number of variant forms, each with a different specificity. For example, the green-fluorescent Alexa Fluor® 488 dye molecule can be modified to target immunolabeling (B), or can act as a whole cell stain (C).
Figure 1. A single fluorophore can be modified to carry out any number of labeling jobs, including functionalized forms for labeling cell structure components such as actin (A) and tubulin (B) and salt forms for whole-cell staining (C).
细胞生物学中使用的许多荧光工具,在本质上是通过各种方式修饰或以不同的方式偶联各种分子的荧光团,目的是赋予他们某种功能或使它们连接到特定细胞器或蛋白上。
通过化学修饰后,一种荧光团可以产生若干不同的变体,每种变体具有不同的特异性。例如,绿色荧光Alexa Fluor 488染料分子可以修饰靶标 肌动蛋白微丝 (A), 可连接到IgG上进行免疫标记 (B), 也可对整个细胞染色(C).
图 1. 一个荧光团可以修饰后起多种标记作用,包括:以各种功能状态标记细胞结构元件,如肌动蛋白(A)、微管蛋白(B);以盐形态进行全细胞染色(C)。
正如上文所述,荧光标记物通常包括一个为获得特异性而进行过修饰的荧光基团。除了链接荧光基团与各种分子,其他类型的修饰也可以赋予荧光基团新的特性。
将荧光基团链接到某个特定的分子(例如抗体)上,可以赋予荧光基团对靶标(本例中为抗原)的选择性。这种方法的优势是荧光基团连接到靶标,在洗掉任何未连接或多余的荧光染料后,即可获得比背景 信号更强的信号和更好的对比度。
荧光染料最初发光比较暗淡,但外部条件或细胞内部活动会引发他们的亮度增加。例如:
荧光染料通常具有很高的信噪比,这是因为经过连接或活化的染料荧光强度激增,而游离/未剪切的染料只有微弱的信号。由于未修饰的荧光染料不是很明亮,所以通常不需要洗涤。
Sometimes you don’t just want to label something; you want to know if your cells are healthy, or if they are functioning the way they should be. You may want to know: are my cells alive? are they apoptotic? or are they stressed out? There are many fluorescent dyes available that can act as indicators for various cellular functions and answer these questions.
For example, the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) specifically labels mitochondria, and it can also indicate if the mitochondria are healthy. Active mitochondria in healthy cells will maintain a mitochondrial membrane potential, and TMRM is brightly fluorescent in these mitochondria. As mitochondrial membrane potential is lost (in sick or dying cells), TMRM signal is diminished.
Figure 2. Panel A shows TMRM staining in healthy HeLa cells; panel B shows the loss of TMRM signal concurrent with treatment to destroy the mitochondrial membrane potential.
有时您可能不只是想标记某些对象;您想知道细胞是否健康,是否具有其应有的功能,您可能还想知道:细胞存活着吗?是否出现了凋亡?或者他们去应激化了吗?许多荧光染料都可作为对各种细胞功能的指示剂,逐一解答上述问题。
例如,荧光染料四甲基罗丹明甲酯(TMRM)专门 标记线粒体, 它也可用来指示线粒体是否健康:健康细胞中的活性线粒体将维持线粒体膜电位,在这些线粒体中TMRM发出明亮的荧光;如果线粒体膜电位破坏(细胞生病或死亡),TMRM信号将减弱。
图 2. 图A显示健康HeLa细胞中的TMRM染色;图B显示线粒体膜电位破坏后TMRM信号丢失。
在人们谈论荧光基团或荧光染料时,您可能常会听到消光系数和量子产率等字眼。这些术语是荧光染料分子的物理性质,使化学家能够了解染料的亮度概念。然而,在生物学研究中,荧光染料具有比消光系数和量子产率更多的特性。对于那些需要在某个生物系统中实际使用这些荧光标志物的科研人员,在成像实验的设计中还应考虑许多其他特性。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。