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通过对首先在自然界发现的荧光蛋白进行修饰,科研人员创造出了一系列在活细胞成像实验之中尤为有用的成像工具衍生物组合。
本节内容包含了有关如何为成像实验选择最适宜的荧光蛋白,如何设计FP融合蛋白,以及如何将其引入细胞的实验小贴士。
部分生物体会产生可自发荧光的蛋白质,科研人员便开发出了利用这些蛋白作为荧光显微研究工具的技术。在活细胞成像实验中,您可能希望进行延时显微成像以观察靶标如何在细胞内发挥功能,此类FP便是格外有益的工具。将FP基因融合到靶标基因之中,即可使FP结合成蛋白标志物。之后,宿主细胞即会制备出永久结合荧光标志物的靶标蛋白,因而也就无需再为样品添加荧光染料。第一种展现出了可作为细胞生物学工具资质的荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP),其于上世纪60至70年代分离自Pacific Northwest jellyfish, Aequorea victoria 水母,但在上世纪90年代确定其完整的基因序列之前,一直未能作为显微生物学工具广泛使用。
图 1. Aequorea victoria水母,供图 Lyn Gateley/CC
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红珊瑚, 供图Nomore3Xfive/CC
如果您正在考虑制备用于荧光成像的荧光融合蛋白,GFP或者更具体地说,原始版本的维多利亚水母GFP增强版,即所谓的增强型GFP或EGFP便是您最佳的选择。这款荧光蛋白为单体、明亮、表现良好、无侵入性且几乎不会失效,其已经过反复验证,因此无论您选择何种生物体或应用,EGFP都是最理想的选择。
与此相反,如果您需要通过红色通道成像,则mCherry是最理想的选择。众多参考文献中提及了很多红色的FP,但是迄今还没有任何其他FP比mCherry的发表文献数目更多,比mCherry更适合Texas Red滤光片光立方。
Venus是一种极其明亮的单体黄色FP,但其并不能很好地适应标准的显微镜滤光片组,因此在您使用Venus时难免要在捕捉信号方面耗费很多的精力,尽管该光谱的蓝色末端很具吸引力,但坦白来讲,除非您的靶标丰度超高,否则您绝对不想使用大多数的蓝色FP,这是因为这一类FP所发出的荧光远较EGFP或mCherry微弱。
最好将您的目的基因放置在DNA序列的3’端,或者放置之后FP融合的C端位置。结构和截短分析结果表明,GFP的N端非常容易被截断,而C端则相对更难截断,大多数FP,当然也包括来自于维多利亚水母GFP的FP——都具有“致软”C端,这就表示,在克服应5’或N端融合引起的位阻效应时,有着更大的自由度。因此,请将您的目的蛋白放置在FP的C端,以最大限度提高表达成功的概率。
图 2. 目的基因的最佳位置就是处于荧光蛋白基因的C端。
接下来,您需要选择将FP结构引入细胞的最佳方法。脂质体转染或病毒转导是最常用的方法。
Figure 3. A neuron expressing GFP, Photo by Jason Synder/CC
疑难解答
固定含GFP的细胞
通常情况下,可采用4%的多聚甲醛(PFA)在15分钟内固定细胞。在进行封闭/透膜步骤之前,用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤若干次,但我们真正要讲述的技巧是,将您的PFA溶液的pH调至pH7.4。通常情况下FP,当然也包括大多数的GFP变体,都会在低于pH6.0的情况下失去荧光。具体操作请见固定,透膜和封闭 实验方案。
检查并纠正GFP融合蛋白信号较弱的情况
最令人沮丧的事情莫过于,千辛万苦将自己的融合蛋白结构导入到细胞,结果发现GFP表达水平很低甚至没有表达。导致蛋白表达水平很低的因素包括与宿主生物体适应性很差的启动子、靶蛋白融合与GFP折叠的位阻效应,以及多聚体亚单位的表达(注定要在内质网内终止),甚至克隆错误。无论遇到什么情况,都不要灰心。
如果您发现荧光较弱,可以尝试采用抗GFP抗体放大所获得的信号。当然,为了使用这一类抗体,很可能要去固定样品,但是还可以调整GFP的颜色,例如,可以选用带有远红外荧光的二抗。
如果发现GFP结构无任何表达的迹象,则可以采用抗-GFP或抗靶标抗体进行一次免疫印迹分析。这一操作可帮助确定是否需要重新来过、重新检查序列,可能还要重新进行亚克隆步骤,或者帮助确定靶蛋白是否正在被快速降解,或者出现更为常见的情况——未能正确折叠。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。