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免疫荧光(ICC/IF)
免疫荧光概述
我们在细胞成像领域深耕近50年，可为您提供值得信赖的研究工具和方案，帮助您首次实验即可获取高品质的细胞图像。Invitrogen™成像试剂和抗体经过广泛验证，享有极高的认可度，且在已发表研究中被频繁引用。
无论您是刚开始进行细胞成像，或者已经富有经验，都可使用以下经过验证的五步法流程，确保轻松获取发表级细胞图像。
五步法高品质固定细胞成像
遵照如下5个步骤采集尽可能完美的固定细胞图像，即使您第一次使用也可获得可供发表的高品质细胞图像
步骤一：细胞和组织样品处理
准备荧光标记的细胞样品
为实现最佳的图像质量，首先应建立针对目的蛋白和细胞结构的研究，同时将其他一切背景等排除在图像之外。固定和破膜细胞样品用于标记 – 首先将细胞结构、蛋白和核酸固定，然后使荧光染料和抗体渗入到细胞内部，标记目的靶点。封闭细胞样品，防止荧光标记物与研究无关的蛋白非特异性结合，最大限度提高信噪比。
固定液将细胞结构锁定。
透化作用可去除细胞膜脂质 - 使标记和检测试剂能够穿过膜孔到达细胞内部。
蛋白封闭液有助于减少非特异染色。抗体能够取代封闭蛋白与其表位形成高亲和力结合，而封闭液可防止样品中的低亲和力结合。
在固定和破膜之后，使用NucBlue活细胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型试剂对U2OS细胞进行染色。图A采用传统甲醇溶液方法固定，图B则采用基于甲醛优化配方的Image-iT固定/透化试剂盒固定。对比可发现，图A中甲醇固定的方法可导致肌动蛋白细胞骨架断裂和细胞破碎，而Image-iT 固定/透化试剂盒则可为绝大多数细胞类型提供最佳固定条件。
步骤二：标记样品
使用细胞器特异性染料、探针和一抗检测细胞结构和蛋白
通过不同颜色荧光标记不同的靶标，可以直观的观察同一样品细胞内不同结构和蛋白。荧光标记靶标的方法主要包括荧光染料、免疫标记、荧光融合蛋白等——这几种方法均可选择性标记细胞内的结构和蛋白，让您在成像时更轻松地进行观察。细胞生物学采用的很多荧光工具基本上都是荧光基团。这些荧光基团经过不同的方法修饰或结合到不同的分子上，从而具备了某些的功能与特定的细胞器或蛋白结合。通过化学修饰，单个荧光基团可以产生许多变体形式，且每种变体都有不同的特异性。例如，发出绿色荧光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子经过修饰后，可以靶向肌动蛋白微丝，可以结合IgG用于免疫标记，还可用作全细胞染料。Invitrogen提供了超过51000种高品质一抗，其中的部分抗体可以直接结合大量明亮的荧光染料和标记物，包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。访问thermofisher.com/primaryantibodies了解我们丰富的荧光染料产品。
推荐产品
Invitrogen提供了100,000多种高质量的一抗，覆盖85%以上的蛋白靶点。其中涵盖一些抗体直标荧光标记物和标签产品，包括Invitrogen的Alexa Fluor染料。
单个荧光基团可以进行任意数量的标记，包括用于标记细胞结构成分的功能化形式，例如（A）肌动蛋白、（B）微管蛋白和（C）Hydrazide全细胞标记。
采用Invitrogen Image-iT 固定/透化试剂盒制备染色用的培养细胞，然后采用Invitrogen BlockAid封闭液处理。先采用能识别线粒体的一抗标记样品，然后与Alexa Fluor 750 染料标记的二抗 （紫色），Invitrogen NucBlue细胞核染料（蓝色） 和Invitrogen ActinGreen 488即用型试剂（绿色）孵育。在Invitrogen EVOS FL全自动细胞成像系统上采集图像。
步骤三：检测样品
优化荧光信号，保证免疫荧光结果
检测复杂的生物学结构需要最高清晰度的荧光信号，并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得最佳信噪比的成像效果。获得良好图片和极佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于：需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和最佳放大倍数。
固定和破膜HeLa细胞，采用Image-iT固定/透化试剂盒之中的试剂处理，与抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后将细胞与抗ATP 合成酶亚型 IF1 抗体一同孵育，并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 试剂盒（山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺）中的试剂进行标记。用NucBlue 可固定细胞即用型染料标记细胞核。采用共聚焦显微镜采集图像。
中等至高丰度的蛋白靶标
二抗可用于间接检测目的抗原。一抗与靶标直接结合，而二抗则以一抗为桥梁，间接结合目标生物分子。这种方法可以放大信号，提高灵敏度，最大限度的检测出靶标。
查找二抗
一抗（橙色和黄色）与靶表位结合后，荧光标记的二抗（紫色和蓝色）结合特异性的一抗。
中等至低丰度的蛋白靶标
链霉亲和素结合物可以提高标记靶标的荧光基团的数量，从而放大信号。基于链霉亲和素信号放大技术广泛应用于荧光成像，用以提高一抗和二抗检测的灵敏度。
进一步了解链酶亲和素信号放大技术用于成像
使用荧光基团-链霉亲和素标记的抗体可以增强信号，因为更多的荧光基团可以与单个抗体分子结合，从而放大信号。
低丰度蛋白靶标
对于传统方法无法检测到的低丰度蛋白靶标，酪胺信号放大技术(TSA)可以在不降低分辨率的前提下，进行灵敏的检测。TSA技术采用了一种能在过氧化氢存在的条件下释放活性染料的酶，从而使靶标明显且清晰的与背景区分开。
详细了解如何采用TSA技术对低丰度靶标成像
酪胺信号放大技术在不影响分辨率的情况下获取优质的灵敏度。
推荐产品
与Alexa Fluor染料相比，Alexa Fluor Plus二抗采用专有的技术，信噪比高达4.2倍，为检测低丰度靶标提供了更高的灵敏度。
Invitrogen Tyramide SuperBoost试剂盒采用 Invitrogen SuperBoost 技术，为低丰度蛋白靶标提供最灵敏的免疫荧光检测方法。SuperBoost试剂盒的灵敏度是标准免疫化学（ICC）、免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）方法的10-200倍，可为低丰度靶标的高分辨成像提供优质的信号放大、定义和清晰度。SuperBoost试剂将Alexa Fluor染料的亮度与值得信赖的poly-HRP酪胺信号放大技术结合，使灵敏度比标准处理方法高2-10倍，包括其他供应商的试剂。
步骤四：保护样品
避免荧光信号发生光漂白，提高免疫荧光图像质量
虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的最佳选择，但不可避免地也极易发生光漂白，即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差，产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性，维持数周乃至数月的图像信号完整度。
推荐产品
Invitrogen ProLong Glass抗淬灭封片剂的设计旨在为整个可见和近红外光谱内提供抗淬灭保护。ProLong Glass封片剂的折射率为1.52，可与多种荧光染料一起用于几乎所有细胞以及深度范围为0.1 µm至150 µm的组织样品，获得明亮、高分辨率的Z-stack、3D和2D图像。由于减少了图像失真，其在油镜和共聚焦显微镜下也能很好地工作。
ProLong抗淬灭封片剂用于固定细胞成像具有以下好处：
- 即使在长时间储存后，仍可以在整个光谱范围内抑制光漂白
- 在整个光谱范围内的背景都很低
- 固化封片剂
- 可选含有或不含DAPI两种形式
- 即用型随取随用优化配方
- 可根据您的需求选择折射率：ProLong Glass试剂为1.52，ProLong Diamond和ProLong Gold试剂为1.47
60秒延时成像显示，使用ProLong抗淬灭封片剂能够提高对光漂白的抵抗性。使用FITC鬼笔环肽标记固定的HeLa细胞，并使用ProLong Glass试剂、ProLong Diamond试剂、ProLong Gold试剂或50% PBS/甘油封片。在使用标准100瓦汞弧灯连续照明的条件下，使用20倍物镜以12秒间隔采集图像。
步骤五：样品成像
保证您的免疫荧光结果具有卓越的分辨率和清晰度
通过采集最高清晰度图像突破研究新发现。在当今激烈的科研竞争环境下，能否快速获得可供发表的高质量图像是决定您成败的关键。想要获取最顶级的图像，就需要配备顶级成像元件的成像平台，包括：
- 高性相机和光学元件，快速采集高分辨率图像
- 全新一代LED光立方，拥有卓越的信噪比表现
- 功能强大的图像采集和分析软件，轻松采集发表级的图像数据
推荐产品
选择简单易用的模块化系统，可以根据您的实验需求进行调整。我们提供可定制的20多种Invitrogen EVOS LED光立方、容器支架和物镜等，涵盖广泛的荧光激发和发射光谱。
需要在提高样品通量的同时获取更多定量数据？Celllnsight CX5高内涵筛选平台提供自动图像采集与同步数据分析，让您在5分钟内分析多达50万个表型细胞。
通过比较以下成像系统，找到最适合您的成像需求的一款产品。
| 基本的倒置透射光数字系统 | 基本的荧光系统 | 高级荧光系统 | 全自动活细胞荧光系统 |
|---|---|---|---|
 EVOS XL Core 适用于细胞培养和常规细胞维持 |  EVOS FLoid 适用于快速荧光图像展示 |  EVOS M5000 适用于多通道荧光成像和转染 |  EVOS M7000 适用于各类高级、自动化应用领域 |
| 5-channel LED 系统 | 7-channel LED confocal 系统 | 7-channel laser confocal 系统 |
|---|---|---|
 CellInsight CX5 非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室 查看试剂 |  CellInsight CX7 非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室 查看试剂 |  CellInsight CX7 LZR 非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室 查看试剂 |
| 基本的倒置透射光数字系统 | 基本的荧光系统 | 高级荧光系统 | 全自动活细胞荧光系统 |
|---|---|---|---|
EVOS XL Core 适用于细胞培养和常规细胞维持 | EVOS FLoid 适用于快速荧光图像展示 | EVOS M5000 适用于多通道荧光成像和转染 | EVOS M7000 适用于各类高级、自动化应用领域 |
| 5-channel LED 系统 | 7-channel LED confocal 系统 | 7-channel laser confocal 系统 |
|---|---|---|
CellInsight CX5 非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室 查看试剂 | CellInsight CX7 非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室 查看试剂 | CellInsight CX7 LZR 非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室 查看试剂 |
步骤一：细胞和组织样品处理
准备荧光标记的细胞样品
为实现最佳的图像质量，首先应建立针对目的蛋白和细胞结构的研究，同时将其他一切背景等排除在图像之外。固定和破膜细胞样品用于标记 – 首先将细胞结构、蛋白和核酸固定，然后使荧光染料和抗体渗入到细胞内部，标记目的靶点。封闭细胞样品，防止荧光标记物与研究无关的蛋白非特异性结合，最大限度提高信噪比。
固定液将细胞结构锁定。
透化作用可去除细胞膜脂质 - 使标记和检测试剂能够穿过膜孔到达细胞内部。
蛋白封闭液有助于减少非特异染色。抗体能够取代封闭蛋白与其表位形成高亲和力结合，而封闭液可防止样品中的低亲和力结合。
在固定和破膜之后，使用NucBlue活细胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型试剂对U2OS细胞进行染色。图A采用传统甲醇溶液方法固定，图B则采用基于甲醛优化配方的Image-iT固定/透化试剂盒固定。对比可发现，图A中甲醇固定的方法可导致肌动蛋白细胞骨架断裂和细胞破碎，而Image-iT 固定/透化试剂盒则可为绝大多数细胞类型提供最佳固定条件。
步骤二：标记样品
使用细胞器特异性染料、探针和一抗检测细胞结构和蛋白
通过不同颜色荧光标记不同的靶标，可以直观的观察同一样品细胞内不同结构和蛋白。荧光标记靶标的方法主要包括荧光染料、免疫标记、荧光融合蛋白等——这几种方法均可选择性标记细胞内的结构和蛋白，让您在成像时更轻松地进行观察。细胞生物学采用的很多荧光工具基本上都是荧光基团。这些荧光基团经过不同的方法修饰或结合到不同的分子上，从而具备了某些的功能与特定的细胞器或蛋白结合。通过化学修饰，单个荧光基团可以产生许多变体形式，且每种变体都有不同的特异性。例如，发出绿色荧光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子经过修饰后，可以靶向肌动蛋白微丝，可以结合IgG用于免疫标记，还可用作全细胞染料。Invitrogen提供了超过51000种高品质一抗，其中的部分抗体可以直接结合大量明亮的荧光染料和标记物，包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。访问thermofisher.com/primaryantibodies了解我们丰富的荧光染料产品。
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Invitrogen提供了100,000多种高质量的一抗，覆盖85%以上的蛋白靶点。其中涵盖一些抗体直标荧光标记物和标签产品，包括Invitrogen的Alexa Fluor染料。
单个荧光基团可以进行任意数量的标记，包括用于标记细胞结构成分的功能化形式，例如（A）肌动蛋白、（B）微管蛋白和（C）Hydrazide全细胞标记。
采用Invitrogen Image-iT 固定/透化试剂盒制备染色用的培养细胞，然后采用Invitrogen BlockAid封闭液处理。先采用能识别线粒体的一抗标记样品，然后与Alexa Fluor 750 染料标记的二抗 （紫色），Invitrogen NucBlue细胞核染料（蓝色） 和Invitrogen ActinGreen 488即用型试剂（绿色）孵育。在Invitrogen EVOS FL全自动细胞成像系统上采集图像。
步骤三：检测样品
优化荧光信号，保证免疫荧光结果
检测复杂的生物学结构需要最高清晰度的荧光信号，并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得最佳信噪比的成像效果。获得良好图片和极佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于：需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和最佳放大倍数。
固定和破膜HeLa细胞，采用Image-iT固定/透化试剂盒之中的试剂处理，与抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后将细胞与抗ATP 合成酶亚型 IF1 抗体一同孵育，并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 试剂盒（山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺）中的试剂进行标记。用NucBlue 可固定细胞即用型染料标记细胞核。采用共聚焦显微镜采集图像。
中等至高丰度的蛋白靶标
二抗可用于间接检测目的抗原。一抗与靶标直接结合，而二抗则以一抗为桥梁，间接结合目标生物分子。这种方法可以放大信号，提高灵敏度，最大限度的检测出靶标。
查找二抗
一抗（橙色和黄色）与靶表位结合后，荧光标记的二抗（紫色和蓝色）结合特异性的一抗。
中等至低丰度的蛋白靶标
链霉亲和素结合物可以提高标记靶标的荧光基团的数量，从而放大信号。基于链霉亲和素信号放大技术广泛应用于荧光成像，用以提高一抗和二抗检测的灵敏度。
进一步了解链酶亲和素信号放大技术用于成像
使用荧光基团-链霉亲和素标记的抗体可以增强信号，因为更多的荧光基团可以与单个抗体分子结合，从而放大信号。
低丰度蛋白靶标
对于传统方法无法检测到的低丰度蛋白靶标，酪胺信号放大技术(TSA)可以在不降低分辨率的前提下，进行灵敏的检测。TSA技术采用了一种能在过氧化氢存在的条件下释放活性染料的酶，从而使靶标明显且清晰的与背景区分开。
详细了解如何采用TSA技术对低丰度靶标成像
酪胺信号放大技术在不影响分辨率的情况下获取优质的灵敏度。
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与Alexa Fluor染料相比，Alexa Fluor Plus二抗采用专有的技术，信噪比高达4.2倍，为检测低丰度靶标提供了更高的灵敏度。
Invitrogen Tyramide SuperBoost试剂盒采用 Invitrogen SuperBoost 技术，为低丰度蛋白靶标提供最灵敏的免疫荧光检测方法。SuperBoost试剂盒的灵敏度是标准免疫化学（ICC）、免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）方法的10-200倍，可为低丰度靶标的高分辨成像提供优质的信号放大、定义和清晰度。SuperBoost试剂将Alexa Fluor染料的亮度与值得信赖的poly-HRP酪胺信号放大技术结合，使灵敏度比标准处理方法高2-10倍，包括其他供应商的试剂。
步骤四：保护样品
避免荧光信号发生光漂白，提高免疫荧光图像质量
虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的最佳选择，但不可避免地也极易发生光漂白，即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差，产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性，维持数周乃至数月的图像信号完整度。
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ProLong抗淬灭封片剂用于固定细胞成像具有以下好处：
- 即使在长时间储存后，仍可以在整个光谱范围内抑制光漂白
- 在整个光谱范围内的背景都很低
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| 基本的倒置透射光数字系统 | 基本的荧光系统 | 高级荧光系统 | 全自动活细胞荧光系统 |
|---|---|---|---|
EVOS XL Core 适用于细胞培养和常规细胞维持 | EVOS FLoid 适用于快速荧光图像展示 | EVOS M5000 适用于多通道荧光成像和转染 | EVOS M7000 适用于各类高级、自动化应用领域 |
| 5-channel LED 系统 | 7-channel LED confocal 系统 | 7-channel laser confocal 系统 |
|---|---|---|
CellInsight CX5 非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室 查看试剂 | CellInsight CX7 非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室 查看试剂 | CellInsight CX7 LZR 非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室 查看试剂 |
| 基本的倒置透射光数字系统 | 基本的荧光系统 | 高级荧光系统 | 全自动活细胞荧光系统 |
|---|---|---|---|
EVOS XL Core 适用于细胞培养和常规细胞维持 | EVOS FLoid 适用于快速荧光图像展示 | EVOS M5000 适用于多通道荧光成像和转染 | EVOS M7000 适用于各类高级、自动化应用领域 |
| 5-channel LED 系统 | 7-channel LED confocal 系统 | 7-channel laser confocal 系统 |
|---|---|---|
CellInsight CX5 非常适合正在寻找小巧经济型系统以扩大实验规模的实验室 查看试剂 | CellInsight CX7 非常适合正在寻找更多成像模式选择的实验室 查看试剂 | CellInsight CX7 LZR 非常适合正在努力提高灵敏度和速度性能的实验室 查看试剂 |
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EVOS DAPI 2.0光立方（AMEP4950）
激发光: 357/44 nm；
发射光: 447/60 nm
EVOS GFP 2.0光立方（AMEP4951）
发射光: 470/22 nm；
激发光: 525/50 nm
EVOS RFP 2.0光立方（AMEP4952）
激发光: 531/40 nm；
发射光: 593/40 nm
EVOS Texas Red 2.0光立方（AMEP4955）
激发光: 585/29 nm;
发射光: 628/32 nm
EVOS Cy5 2.0光立方（AMEP4956）
激发光: 628/40 nm;
发射光: 685/40 nm
EVOS DAPI 2.0光立方（AMEP4950）
激发光: 357/44 nm；
发射光: 447/60 nm
EVOS GFP 2.0光立方（AMEP4951）
发射光: 470/22 nm；
激发光: 525/50 nm
EVOS RFP 2.0光立方（AMEP4952）
激发光: 531/40 nm；
发射光: 593/40 nm
EVOS Texas Red 2.0光立方（AMEP4955）
激发光: 585/29 nm;
发射光: 628/32 nm
EVOS Cy5 2.0光立方（AMEP4956）
激发光: 628/40 nm;
发射光: 685/40 nm
免疫荧光实验手册及资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。
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