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流式细胞术细胞计数微球
流式细胞术细胞计数分析能够快速地量化细胞的特征，但多数的流式细胞术细胞计数分析却不能直接检测样品中细胞的浓度或实现绝对计数。绝对细胞计数微球现在广泛应用于细胞计数实验以及疾病进展研究中，尤其是干细胞研究领域。获取绝对细胞计数一般通过两种方法，一种是将来自细胞分析仪器中检测的细胞浓度与流式细胞术细胞计数分析的细胞群数据相结合（多平台检测），另一种向流式细胞样品中加入内部微球计数标准品（单平台检测）。单个平台检测方法十分简单，避免实验室间差异，从而更加准确、更受青睐。
赛默飞为您提供用于细胞计数和细菌计数的多种流式微球：Invitrogen CountBright Plus、CountBright 绝对计数微球以及Invitrogen AccuCheck 计数微球。不仅如此，赛默飞还有Invitrogen LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒——即使多种细菌菌群相互混合，仍然可以对活菌或死菌进行有效鉴定并定量检测。
如何选择合适的流式计数微球？
| CountBright Plus 绝对计数微球 | CountBright 绝对计数微球 | AccuCheck 计数微球 | |
|---|---|---|---|
| 样品类型 | 任意类型，包括全血和裂解/未经洗涤的全血 | 任意类型 | |
| 微球大小 | 4 µM | 7 µM | 微球 A: 6.40 µM 微球 B: 6.36 µM |
| 激发 (nm) | UV 至 808 nm | UV 至 635 nm | 微球 A: 488 微球 B: 635 |
| 发射（nm） | 385 至 860 | 385 至 800 | 微球 A: 575–585 微球 B: 660–680 |
| 测量参数 | 细胞数量 | 细胞数量 | 细胞数量及移液精准度 |
| 货号 | C36995 | C36950 | PCB100 |
| LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒 | |
|---|---|
| 样品类型 | 细菌样品 |
| 微球大小 | 6 µM |
| 激发 (nm) | 不发荧光 |
| 最大发射波长 (nm) | NA |
| 测量参数 | 活细菌（或死细菌）数量，以及微球区域数量 |
| 货号 | L34856 |
| CountBright Plus 绝对计数微球 | CountBright 绝对计数微球 | AccuCheck 计数微球 | |
|---|---|---|---|
| 样品类型 | 任意类型，包括全血和裂解/未经洗涤的全血 | 任意类型 | |
| 微球大小 | 4 µM | 7 µM | 微球 A: 6.40 µM 微球 B: 6.36 µM |
| 激发 (nm) | UV 至 808 nm | UV 至 635 nm | 微球 A: 488 微球 B: 635 |
| 发射（nm） | 385 至 860 | 385 至 800 | 微球 A: 575–585 微球 B: 660–680 |
| 测量参数 | 细胞数量 | 细胞数量 | 细胞数量及移液精准度 |
| 货号 | C36995 | C36950 | PCB100 |
| LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒 | |
|---|---|
| 样品类型 | 细菌样品 |
| 微球大小 | 6 µM |
| 激发 (nm) | 不发荧光 |
| 最大发射波长 (nm) | NA |
| 测量参数 | 活细菌（或死细菌）数量，以及微球区域数量 |
| 货号 | L34856 |
CountBright绝对计数微球& CountBright Plus绝对计数微球
- 兼容性—适用于更多流式荧光、更宽的激发光谱和发射光谱
- 易用性—方案简单，适用于多种细胞类型
- 重复性—与多平台测试相比，结果更可靠
CountBright绝对计数微球和CountBright Plus绝对计数微球是经过校准的微球悬浮液，包含已知浓度的微球，可以在超宽范围内激发和发射光谱中发出明亮荧光。在绝对定量实验中是向一定体积的样本中加入相对体积的微球悬浮液，因此可以确定样本体积和微球体积之比。根据样本及微球的体积比例对照微球同体积比例里的数量，推算出同体积比例的细胞数量确定细胞浓度。通常需要收集 1,000 个微球数据，可以保证样本体积计算具有统计学意义。
CountBright 和 CountBright Plus 绝对计数微球可用于任意样本类型，包括裂解或者未经洗涤的全血样本。CountBright绝对计数微球的直径约为7 µm，沉降性质与淋巴细胞相似。相比之下，CountBright Plus绝对计数微球的直径约为4 μM，沉降性质使其在分析全血时表现出 T、B 和 NK 细胞群成比例的阳性峰。还有，CountBright Plus 微球可以适用于从紫外到近红外的最宽范围上的激发和发射光谱。
CountBright Plus 绝对计数微球提供：
- 激发范围最广—从 UV 到 810 nm（近 IR）激光激发
- 发射范围最广—从 385 到 900 nm（近 IR）激光发射
- 成比例—微球与大多数细胞类型（包括人全裂解血）成比例，易于使用
- 准确度更高—>95％ 的单峰，提高了准确度
不管使用 CountBright 还是 CountBright Plus 绝对细胞计数微球，都应避免可能导致细胞或微球丢失的样品制备步骤，例如洗涤。CountBright Plus 绝对计数微球可用于散射或荧光阈值。当使用散射阈值进行分析时，微球的信号应高于阈值。流式计数微球可以使用单一参数进行分析，但也可以使用多个参数组合以便将微球和细胞及其他微粒区分开。
图 1：CountBright Plus 绝对计数微球可以与更多流式荧光染料同时使用。当使用带有840/20发射滤光片的IR激光（808 nm）激发时，CountBright Plus 微球（红色）可以与裂解全血中的 CD19 APC-eFluor780 染色细胞（粉色）同时检出；这是与CountBright 绝对计数微球不同的。
图 2：CountBright Plus绝对计数微球可以由从紫外光到近红外光全光谱激发。在从385 nm到860 nm的全部荧光通道中都可以检测到CountBright Plus细胞计数微球，而在近红外通道中检测不到CountBright绝对计数微球（上面的G波峰）。
图 3：在全血样本分析中，CountBright Plus绝对计数微球可与 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞群在同一图中显示。正常人外周血使用抗人 CD3 Alexa Fluor 488 和抗人 CD19 PE-Cy7 染色，然后使用 1-Step™Fix/Lyse 溶液裂解。使用流式细胞仪进行分析之前，将 CountBright Plus 绝对计数微球（盒装，紫色）添加到样品中。
AccuCheck 计数微球
- 采用两种不同颜色微球作为实验准确度的内参
- 直接在流式样本中加入微球标准品的方法更受青睐，且结果一致性高
- 可通过免疫分型实验进行验证
AccuCheck 计数微球是用于绝对细胞计数的高效检测方法，使用了两种不同荧光微球（微球A和B）直接结合到流式细胞免疫分型实验中；这两种荧光微球还是计算全血体积的双重内参。
向已知体积的经裂解或未洗涤全血样品中加入相同体积的AccuCheck计数微球，微球会同细胞共同计数。由于微球的浓度是已知的，每毫升中细胞数量（绝对技数）可通过将计数得到的细胞数与荧光微球总数关联计算得出，随后通过每单位体积中总荧光微球的数量相乘而得到相应细胞的数量。由于AccuCheck计数微球中的两种荧光微球的比例是已知的，可以通过微球比例确认移液的精准度。
LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒
LIVE/DEAD BacLight 细菌活力和计数试剂盒是通过流式细胞仪区分出活/死菌以及定量分析，甚至可处理混合多种细菌类型的菌群（图 4）。该试剂盒利用两种核酸染料（绿色荧光：Invitrogen SYTO9 染料；红色荧光：碘化丙啶染料）进行细菌活力测定，并配有微球标准品，方便精确校准样品的体积。因此，通过SYTO9和碘化丙啶染料，具有完整细胞膜的细菌会被染上明亮的绿光，而细胞膜受损的细菌则会显示出明显减弱的绿光或是红光，细菌类型及革兰氏特征会影响死细菌上的红光总量。SYTO9和碘化丙啶染料可以被流式细胞仪中488 nm激光器有效地激发，并且染料与细菌核酸结合后也能在绿色和红色通道中被检测出来；但背景几乎无荧光。
微球标准品可以用作校准样品体积。微球标准品中的微球和荧光都经过研发测试，确保它们能在荧光-侧向散射细胞散点图中，与任何染色的细菌群体清晰地分辨出来。使用SYTO9染料和碘化丙啶的混合试剂按比例进行染色细菌培养液，然后在上样到流式细胞仪前，加入固定数量的微球。活细菌和死细菌以及微球标准品都能非常容易地从荧光-侧散射散点图中区分出来。然后，活细菌和死细菌的浓度可依据染色后细菌与微球的比率来确定。
图 4：采用Invitrogen LIVE/DEAD BacLight 细菌活力和计数试剂盒分析细菌培养物。按照试剂盒操作步骤，活的（未处理的）和死的（乙醇处理的）金黄色葡萄球菌（图 A 和 C）和大肠杆菌（图 B 和 D）的悬浮液与 SYTO9和碘化丙啶进行染色，再利用流式细胞仪进行分析。绿色或红色荧光-侧散射（green or red fluorescence versus side scatter）细胞散点图（图 A 或 B）被用来区分细菌群体与微球群体（分别为左框和右框）。在每个细胞散点图中的细菌区域的结果又以红色荧光-绿色荧光细胞散点图的形式进行了显示（图 C 和 D）。每毫升中活细菌和死细菌浓度可以从荧光-侧散射细胞散点图或绿色荧光-红色荧光细胞散点图中计算得到，其选择取决于哪一个图能更好的将活细胞群体和死细胞群体分开。活细胞群体和死细胞群体在这些细胞散点图中的位置可能取决于细菌类型和革兰氏性质。一些样品的散点结果可能会因为流式仪器不同参数设定落在散点图以外，这需要进行适当地参数调节 （例如图 D）。
资源
Invitrogen eBioscience资源中心：选择指南，Best Protocols以及更多
流式学习中心：这里有丰富的流式资源，助您更好地完成实验
Panel Builder流式配色工具：五步轻松选择设备、抗原以及荧光，简单完成配色！
5 步法资源
支持
未经允许，不得转售。Super Bright聚合染料在Becton, Dickson and Company许可下售卖。