流式荧光补偿微球

什么是流式荧光补偿微球?

流式荧光补偿微球搭配物种特异性的流式抗体相使用,还有其他类型试剂。它的目的是调整电压和画门参数,最终得到准确的荧光信号。在下述情形下,建议使用流式荧光补偿微球:

  • 在同一检测通道中,多个荧光染料发射光谱相互重叠(图1)
  • 低表达蛋白标记物在阳性和阴性细胞群中表现差异不明显
  • 样本十分稀少,但可以跑完对照及得到足够的有效数据
  • 在超多色免疫分型Panel中可以设置准确的单色补偿
  • 在多色实验中微球对照可以实现标准化及节省样本

使用下方表格,选择在您的实验中合适的流式荧光补偿微球。



流式荧光补偿微球选择指南

建议选择流式荧光补偿微球的标准是可以区分出抗体的阳性信号和阴性信号,我们有多种流式荧光补偿微球,适用于流式抗体、荧光蛋白及试剂。

 UltraComp eBeads Plus 补偿微球*AbC 总抗体补偿微球试剂盒*
应用免疫分型免疫分型
反应性人、兔、仓鼠、小鼠和大鼠来源抗体以及识别κ和λ链仓鼠、小鼠、兔及大鼠抗体
形式单管预混,每次一滴1管阳性微球 1管阴性微球
激光适用于多数标准激光,从紫外光到633nm,尤其适合在紫激光上聚合物染料抗体。适用于多数标准激光,从紫外光到633nm。
规格25 tests | 100 tests25 tests | 100 tests
货号01-3333-41 | 01-3333-42A10513 | A10497
*我们还有更多抗体结合补偿微球;绵羊和山羊宿主应使用单色细胞对照及FMO对照,而非微球。
 ArC 胺反应补偿微球试剂盒
应用细胞活性检测
反应性LIVE/DEAD 可固定细胞活性染料*
规格1 管阳性微球; 1 管阴性微球
激光可兼容大部分标准激光,从紫外光至633nm激光
规格25 tests | 100 tests
货号A10628 | A10346
*同样适用于胺反应染料
 GFPmCherryRFPCFPYFP
应用GFP (绿色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的GFP
mCherry (单体红色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的mCherry
RFP (红色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的RFP
CFP (青色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的CFP
YFP (黄色色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的YFP
反应性GFP 亚型mCherry 亚型RFP 亚型CFP 亚型YFP 亚型
形式单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴
激光488 nm561 nm561 nm405 nm488 nm
规格1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)
货号A10514A54743A54740A54742A54743
 UltraComp eBeads Plus 补偿微球*AbC 总抗体补偿微球试剂盒*
应用免疫分型免疫分型
反应性人、兔、仓鼠、小鼠和大鼠来源抗体以及识别κ和λ链仓鼠、小鼠、兔及大鼠抗体
形式单管预混,每次一滴1管阳性微球 1管阴性微球
激光适用于多数标准激光,从紫外光到633nm,尤其适合在紫激光上聚合物染料抗体。适用于多数标准激光,从紫外光到633nm。
规格25 tests | 100 tests25 tests | 100 tests
货号01-3333-41 | 01-3333-42A10513 | A10497
*我们还有更多抗体结合补偿微球;绵羊和山羊宿主应使用单色细胞对照及FMO对照,而非微球。
 ArC 胺反应补偿微球试剂盒
应用细胞活性检测
反应性LIVE/DEAD 可固定细胞活性染料*
规格1 管阳性微球; 1 管阴性微球
激光可兼容大部分标准激光,从紫外光至633nm激光
规格25 tests | 100 tests
货号A10628 | A10346
*同样适用于胺反应染料
 GFPmCherryRFPCFPYFP
应用GFP (绿色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的GFP
mCherry (单体红色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的mCherry
RFP (红色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的RFP
CFP (青色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的CFP
YFP (黄色色荧光蛋白);
微球被标记了3种强度的YFP
反应性GFP 亚型mCherry 亚型RFP 亚型CFP 亚型YFP 亚型
形式单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴单管预混,每次一滴
激光488 nm561 nm561 nm405 nm488 nm
规格1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)1 mL (25 tests)
货号A10514A54743A54740A54742A54743

UltraComp eBeads Plus流式补偿微球

两张直方图显示了使用UltraComp eBeads Plus与BV421和BV785抗体结合的未补偿和补偿数据

您在紫激光和紫外光上使用更多聚合物染料么?还在设计超多色流式Panel,补偿准确要求更高?

了解更多UltraComp eBeads Plus流式补偿微球



荧光补偿对照及微球

在流式多色实验中,若有荧光溢漏则需要补偿调节(图1)。基于抗原表达强度、荧光染料亮度及检测通道相间隔,选择合适荧光染料可以减少荧光溢漏效应,在小实验中可能不需做补偿调节。但是在更多参数和更多染料的实验中,调节光谱重叠的难度也随之更高。计算补偿需要未染色对照、FMO对照(fluorescence minus one)以及单色样本对照:

  • 未染色样本可以确定自发荧光;
  • FMO对照可以评估其他荧光染料及背景补偿调节的影响;
  • 所有实验中需要使用荧光补偿微球这样的单色对照,调整画门条件及优化电压,得到清晰的阳性和阴性信号。

未染色样本及单色对照在光谱流式上同样设置参数。如果荧光补偿微球与样本一样亮或更亮,或若样本和微球的光谱非常不同,这时荧光补偿微球很有用。

显示3种荧光体激发和发射光谱的图示

图1.Panel Builder流式配色工具中三个荧光染料的发射光谱相互重叠案例。如果发射光谱很宽,荧光通道会有光谱重叠,这时其他荧光染料会由不同检测通道所检测。发射信号光谱重叠或荧光溢漏会产生误差。为了避免荧光溢漏,荧光补偿微球的计算机制是在同一检测通道中减去两个荧光染料的重叠部分,得到目标荧光信号。


荧光补偿

当在单一实验中使用两种或更多荧光染料时,一些特定荧光染料的部分散射光谱可能会与另一种荧光染料的检测范围相重合。为了确保荧光信号的检测具有特异性,荧光补偿的过程就是将混入该通道的其他荧光染料的信号进行数学上的削减。为了计算需要多少量的荧光补偿,必须在每次实验中使用单色对照样品。来自单一荧光染料但在其他通道里被检测得到的信号将会被检测到并通过荧光补偿将相应的信号进行去除。诸如Invitrogen UltraComp eBeads、OneComp eBeads和AbC抗体补偿微球,或者是经过实验中所使用的抗体进行染色的细胞,都可以用作单色对照。

光谱重叠图解

图1: 荧光补偿是通过数学算法对流式细胞数据进行校正来去除光谱的重叠。

荧光补偿微球的优势

荧光补偿微球可为流式细胞分析的补偿设置提供一种一致、准确并简易使用的工具。一致的荧光补偿微球可帮助用户避免因使用较弱荧光样品细胞进行补偿设置时而产生的不良补偿效果。荧光补偿微球可在多色实验的补偿中展现出一流的实用性,并还可与实验中使用的相同抗体进行联合使用(而非例如更亮的CD4替代物)。

荧光补偿微球适用于以下情况:

  • 需要使用较强的信号对阳性细胞群进行补偿 
  • 使用多孔板或较大规模实验时
  • 细胞量有限,不能用于补偿对照

UltraComp eBeads Plus及OneComp流式补偿微球

OneComp eBeads流式补偿微球是一种聚苯乙烯微球,在一管中同时含有抗体包被的阳性补偿微球以及未包被的阴性补偿微球。单滴加样使得eBeads加样更为轻松。UltraComp eBeads流式补偿微球具有与OneComp eBeads流式补偿微球相同的优势,但经优化后更适合用于紫色激光,但仍有部分紫光通道不兼容。UltraComp eBeads Plus流式补偿微球完全适用所有紫光通道,与抗体可以结合的物种也增加了兔及人两个种属。

了解更多关于 Ultracomp eBeads Plus及OneComp流式补偿微球的信息

UltraComp eBeads染色图

图 2. 采用UltraComp eBeads 以及13种不同的Invitrogen eFluor 450染料偶联单克隆抗体进行染色,包括流失细胞实验中常用的每一种亚类。每种抗体取0.25 ug染色微球并通过流式细胞仪进行分析。每一组直方图代表一种染色的抗体(除大鼠IgG2a及仓鼠抗体的亚型和抗体被标注出,其他克隆及同位型在右侧进行了标注)。

 


Abc 总抗体及 ArC 胺反应补偿微球

AbC 总抗体补偿试剂盒

三种 AbC 补偿微球试剂盒含有两种类型经特异修饰的聚苯乙烯微球:1)AbC捕获微球(也称为阳性微球),可与所有的特异性免疫球蛋白结合;2)阴性微球,不具有任何抗体结合能力。在与偶联有荧光素的一抗(不同试剂盒可能为小鼠、大鼠、仓鼠或兔抗)进行孵育后,两种不同的补偿微球可达到完全不同的阳性和阴性微球群体用于补偿设置。AbC 微球试剂盒设计用途是在进行阳性微球标记后再加入阴性微球,以避免在荧光逐渐向阴性微球转移。

四张直方图显示AbC™总抗体补偿珠套件的染色情况

图 3. 展示AbC 总抗体补偿微球试剂盒染色情况的四个直方图。直方图展示了与小鼠(左上)、大鼠(右上)、仓鼠(左下)单克隆抗体以及兔(右下)单克隆和多克隆抗体结合后,阳性捕获微球与阴性微球的信号分离。捕获微球上标记有最佳量的每种PE抗体偶联物并在Invitrogen Attune声波聚焦流式细胞仪上使用 488 nm激发波长和574/26带通滤波器进行分析。

ArC 胺反应补偿微球

Invitrogen ArC 胺反应补偿微球与 AbC 总抗体补偿微球具有相同的激光兼容性并具有两管形式,但可专门用于补偿 Invitrogen LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂

ArC补偿珠套件直方图

图4: 采用 ArC胺反应补偿微球试剂盒以及 3种 LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒得到的染色图谱。 (A) LIVE/DEAD可固定紫色染料染色微球 在405 nm 激发发射并用 450/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (B) LIVE/DEAD可固定绿色染料染色微球 在488 nm 激发发射并用 525/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (C) LIVE/DEAD可固定红色染料染色微球 在633 nm 激发发射并用 660/20 nm 带通滤波器进行收集分析。


荧光蛋白补偿微球

BrightComp eBeads荧光补偿微球

BrightComp eBeads荧光补偿微球是经过染色的微球,在GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP上都表现有3种强度的荧光特征。BrightComp eBeads可以对样本中的GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP轻松完成补偿调节(图5)。这些荧光补偿微球的优势有:

  • 轻松完成GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP的补偿调节,结果可重复且准确;
  • 单管预混,每次一滴,一滴中含有阴性微球和阳性微球,十分轻松上手!

即刻在实验中使用BrightComp eBeads补偿微球,节省更多样本

5张流动直方图显示BrightComp eBeads荧光补偿珠各色荧光信号的强度
 点击放大

图5. BrightComp eBeads荧光补偿微球表现出不同的强度。荧光蛋白表达了不同水平,使得流式检测出不同的荧光强度。在补偿调节中建议选择比实验样本表达强度更高的微球波峰。这里的数据是在流式细胞仪上使用488 nm激光和525/50 nm滤光片收集GFP发射光谱,使用561 nm激光和620/15 nm滤光片收集mCherry发射光谱,使用561 nm激光和发射使用585/16 nm滤光片收集RFP发射光谱,使用488 nm激光并使用530/30 nm滤光片收集YFP发射光谱, 使用405 nm 激光器并使用 440/50 nm 滤光片使用 CFP 发射光谱。


资源

流式荧光染料及功能检测试剂选择指南

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光谱流式基础知识

Invitrogen eBioscience 资源中心:选择指南、实验方案、产品介绍以及更多。

流式胞内染色示意小视频:细胞因子和胞内靶标检测。

流式细胞术学习中心:获取流式细胞术学习资源,以轻松计划、顺利开展流式实验。

Panel Builder流式配色工具:流式大神都在用的配色工具,轻松解决多色流式实验的配色难题。

5步法实验资源

支持

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