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1）从健康细胞开始
a.转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。 这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
b. 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
c. 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。 如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
i. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。 我们建议您使用TrypLE™试剂使细胞脱壁。 TrypLE™试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的TrypLE™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
ii. 传代条件取决于所用的细胞系。 部分经验法则：
- 对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时（如HEK-293细胞），按1：10的比例分瓶。
- 对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时（如原代细胞），按1：5的比例分瓶。
d. 保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。 传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
2) 进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
a. 开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
b. 计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料： Opti-MEM 培养基，Lipofectamine 2000 或Lipofectamine LTX试剂，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。
3) 转染时，请使用优质DNA。
a. 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
b. 通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。
c. 在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
d. 制备的工作浓度为0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac浓缩仪或透析过滤装置（例如，Amicon超滤管）来浓缩DNA。
4) 转染当天，将细胞铺板。
a. 如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降。
b. 转染时，细胞密度保持在汇合率为70–90%。
c. 转染时，细胞密度影响转染效率。 为了简化转染优化过程或节省时间，我们建议细胞铺成2种不同的密度，以确保较高的转染效率。
d. 细胞的铺板和转染可同时进行，或者通过反向转染操作进行。 反向转染操作中，使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。
e. 转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中，且不会影响转染效率。
5) 准备脂质体-DNA复合物。
a. 为了获得最理想的试验结果，我们建议在Opti-MEM培养基中混合脂质体和DNA。 另一种方法是使用无血清培养基。
b. 在Opti-MEM培养基中稀释脂质体。 在第二管Opti-MEM培养基中稀释DNA，然后和等体积脂质体溶液混合。 该2步稀释法可获得更优质的数据，比脂质体直接加入稀释的DNA中的方法获得的结果更有重复性。
c. 脂质体一旦在Opti-MEM培养基中稀释，在加入稀释的DNA之前，推荐孵育时间为2- 5分钟。 稀释的脂质体孵育时间不要超过20]分钟。
d. DNA的Opti-MEM溶液更加稳定，最早可以提前4小时制备，但不要太早。
e. 等体积稀释的脂质体和DNA溶液等体积混在一起后，通过缓慢地上下吹打来混合溶液，也可轻弹试管底部，或者快速涡旋混合。
f. 脂质体/DNA复合物温育5-10小时后，将复合物转移到含有细胞和生长培养基的孔中。 将复合物滴加到培养基上，然后轻轻地晃动板子。 切勿剧烈地将孔中的脂质体/DNA复合物分散，否则会使细胞移位。
6) 利用含GFP或LacZ之类报告基因的质粒作为阳性对照，评估转染效率。
利用显微镜（例如FLoid™细胞成像工作站）或流式细胞仪（例如Attune声波聚焦流式细胞仪）可轻松测定转染细胞和GFP蛋白表达细胞的百分比。 可使用ToxBLAzer™试剂盒来测定LacZ基因的表达。
a. 转染后24-48小时，应该可以看到或检测到质粒的表达。
b. 阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与感兴趣的质粒共转染。 共转染过程中，在加入稀释的脂质体之前，可在Opti-MEM培养基中将50–100ng带GFP的质粒和100 ng感兴趣的质粒混合。
仅供研究使用。 不得用于人类或动物的治疗或诊断用途。
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