PCR基础知识

PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三个连续步骤：（1） 变性，对双链DNA模板进行加热，使其解离；（2） 退火，被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；（3） 延伸，DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。将这些步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝（图1）。

多年以来，PCR的基本原理一直未变，但随着 DNA聚合酶 和试剂性能的大幅提升，以及 仪器 和 塑料 耗材 的不断创新，PCR实验方法也在不断改进。

图 1.PCR的三个步骤——变性、退火和延伸——如第一个循环所示，目标DNA随重复循环而发生指数扩增。
 

DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸（图 2）。

早期的PCR，通常使用来源于 大肠杆菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链[3]。但是，这种 大肠杆菌酶对热敏感，易受到变性阶段高温度的破坏，从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此，需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。

热稳定DNA聚合酶的发现是一项重大进步。它实现了长时间的反应稳定性，为PCR方法的改进提供了无限可能。1976年，从耐热菌 Thermus aquaticus 中分离出来的Taq DNA 聚合酶是最有名的热稳定DNA聚合酶之一 [5,6]。1988年研究人员首次报道，证明 Taq DNA 聚合酶能够在 75°C以上保持活性，从而无需手动加入新鲜的酶即可持续循环扩增，实现了工作流程自动化。此外，与 大肠杆菌 DNA聚合酶相比， Taq DNA 聚合酶能够获得更长的PCR扩增子，并且具有更高的灵敏度、特异性和得率。也因此， Taq DNA 聚合酶被 《科学》 杂志评为1989年的“年度分子”[8]。

尽管 Taq DNA 聚合酶大大改善了PCR实验方法，但也表现出一些缺点。例如，TaqDNA 聚合酶在90°C以上的DNA链变性温度中相对不稳定。对于需要更高解离温度的富含GC和/或具有强二级结构的DNA模板而言，这一问题尤为明显。同时， Taq DNA 酶还缺乏校正活性，会在扩增期间引入错误核苷酸。对于克隆和测序而言，序列的准确性至关重要，所以不能存在含有错配的PCR扩增子。此外， Taq DNA 聚合酶的易错配特性使其通常无法稳定扩增长度大于5 kb的片段。为克服这些缺点，性能更好的DNA聚合酶不断被开发出来，使PCR在广泛的生物学应用中发挥其强大的功能（了解关于 DNA 聚合酶特点的更多信息）。

图 2：DNA聚合酶沿5′至3′方向使PCR引物延伸。

热循环仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器。在引入热循环仪之前，PCR反应是一个费时费力的过程，需在不同温度的水浴之间转移样品，并为每个步骤需要精确定时。热循环仪和 Taq DNA 聚合酶的发现，让PCR的自动化成为现实。第一款自动化PCR热循环仪是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合资方式引入市场的[9]。此后， 热循环仪 的实用性、设计、温度控制和循环速度不断得到改善（图 3）。热循环仪也为 定量PCR仪 的开发开拓了道路，定量PCR仪将PCR扩增和PCR产物累积的实时检测结合在一起（了解关于 定量PCR的更多信息）。

1. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R et al.(1971) Studies on polynucleotides.XCVI.Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.J Mol Biol56(2):341–361.
2. Panet A, Khorana HG (1974) Studies on polynucleotides.The linkage of deoxyribopolynucleotide templates to cellulose and its use in their replication.J Biol Chem249(16):5213–5221.
3. Saiki RK, Scharf S, Faloona F et al.(1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science230(4732):1350–1354.
4. Mullis KB, Faloona FA (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol155:335–350.
5. Brock TD, Freeze H (1969) Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile.J Bacteriol98(1):289–297.
6. Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976) Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus.J Bacteriol 127(3):1550–1557.
7. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science239(4839):487-491.
8. Guyer RL, Koshland DE Jr (1989) The Molecule of the Year.Science246(4937):1543-1546.
9. Smithsonian Institution Archives.The history of PCR (RU 9577)