PCR循环参数—成功的六大关键因素

图 1.PCR的主要步骤—变性、退火、延伸—从模板DNA扩增目标序列。
 

在PCR起始阶段，采用变性步骤将双链DNA模板解离成单链，从而使引物可与目标区域结合并开始延伸。起始DNA的完全变性，有助于确保在第一个扩增循环期间实现有效的目标序列扩增。此外，此步的高温条件有助于使样品中可能存在的热不稳定性蛋白酶或核酸酶失活，从而保证它们极小影响热稳定性DNA聚合酶。当使用热启动DNA聚合酶时，此步同时可以激活该聚合酶，虽然酶供应商推荐单独酶激活步骤。

起始变性步骤通常是在94–98°C下孵育1-3分钟。该步骤的时间和温度取决于模板DNA的性质和缓冲液的盐浓度。例如，哺乳动物基因组DNA可能比质粒和PCR产物需要更长的孵育时间（具体取决于DNA的复杂程度和大小）。同样，高GC含量（如， >65%）的DNA通常需要更长的孵育时间或更高的温度（图2）。高盐浓度的缓冲液（满足某些DNA聚合酶的需要）同样需要更高的变性温度（如，98°C），以使双链DNA解离（图3）。

在95°C以上长时间孵育，很容易使 Taq DNA 聚合酶等DNA聚合酶变性。为弥补在该步骤中酶损失的活性，可能需要在起始变性步骤后添加更多的酶，或在一开始加入多于建议用量的DNA聚合酶。高度 热稳定的酶（如来自 Archaea 的酶）能够耐受长时间高温孵育，在整个PCR过程中保持活性（了解关于 DNA聚合酶特点的更多信息）。

起始变性步骤后，后续PCR循环以一个独立的变性步骤开始，并在94–98°C条件下持续0.5-2分钟。与起始模板DNA变性步骤一样，该步骤的时间和温度也可根据模板DNA、DNA聚合酶和缓冲液成分的性质进行优化。 例如，更长时间和/或高温条件对长片段和/或富含GC的目的片段可能是有利的（图2,3）。甘油、DMSO、甲酰胺和甜菜碱等添加剂的存在，可促进变性步骤期间双链DNA的解离并提高特异性，从而无需长时间或高温条件（参见 反应组成考虑因素）。

图 3.不同变性温度的PCR结果。在该实验中，当变性温度低于建议温度（如，90°C和92°C）时，会使扩增来自lambda gDNA的5 kb片段产生不良的扩增效果。

在该步骤中，降低反应温度，使引物与目标DNA结合。通常，0.5-2分钟的孵育时间足以供引物完成退火。通过计算PCR扩增引物的熔解温度（T_m），可确定退火温度。根据一般经验法则，起始退火温度比引物最低T_m低3–5°C。

T_m 指50%的引物与其互补序列形成双链时的温度，可通过多种方法进行计算。引物 T_m估算最简单的方法是利用DNA寡核苷酸中的核苷酸数量进行计算，公式如下：

T_m = 4 (G + C) + 2 (A + T)

由于反应的盐浓度 (Na⁺) 会影响引物退火，因此，使用以下公式能够更加准确地计算 T_m：

T_m = 81.5 + 16.6(log[Na⁺]) + 0.41(%GC) – 675/引物长度

利用每个相邻二核苷酸对的热力学稳定性，结合盐和引物的浓度，还可使用Nearest Neighbor法计算T_m [1,2]。我们的 在线工具 以此法为基础，为指定DNA聚合酶计算建议的引物退火温度。

T_m 计算需考虑的一个重要因素是PCR添加剂、辅助溶剂和修饰核苷酸的使用。这些试剂的存在会降低引物-模板复合物的 T_m 。例如，10% DMSO会使退火温度降低5.5–6.0°C [3]。同样，在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也会降低 T_m。此时，应相应调整退火温度。

应注意，计算所得 T_m 值就是引物退火的起始参考温度。退火温度可能需要根据扩增结果进行进一步优化。例如，如果结果为无扩增条带或扩增水平很低，则优化时应以2–3°C增量逐渐降低退火温度。但是，如果出现非特异性PCR产物，则以2–3°C增量逐渐提高温度（最高至延伸温度），提高特异性（图 4）。

图 4.不同退火温度下的PCR扩增结果。在该实验中，引物对的计算退火温度为54°C。

为优化退火温度，通常选用梯度PCR热循环仪模块，最高和最低温度设置可遍及整个模块，因此，可同时评估多个孔或反应间的温度差异。在实际情况中，真正的梯度和精确孔温控制是难以实现的，因此，推荐在PCR优化中使用具有独立加热/冷却单元的“优于传统梯度”的VeriFlex模块进行精确的温度控制（ 图 5 ）。

图 5.采用“优于传统梯度”和真正梯度技术的PCR热循环仪模块温度对比。

引物退火后，便是延伸引物的3'末端，产生模板的互补链。该步中，DNA聚合酶的5′→ 3′聚合酶活性引入dNTP并合成子链。反应温度升高至酶的最佳温度（热稳定DNA聚合酶的最佳温度通常为70–75°C），使其达到最高活性。如果引物退火温度与延伸温度相差不超过3°C，则退火和延伸温度可合并为一步，称为 两步PCR法，可取代传统的三步PCR法。两步PCR法无需在退火和延伸之间转换和稳定温度，从而缩短了PCR所需的时间。

PCR的延伸时间取决于DNA聚合酶的合成速度以及目标DNA的长度。Taq DNA 聚合酶的一般延伸时间是1分钟/kb，而 Pfu DNA 聚合酶为2分钟/kb。因此，“缓慢型”聚合酶比“快速型”聚合酶需要更多的扩增时间，才能获得相等的得率（图 6）。同样，长DNA扩增子比短DNA需要更长的延伸时间，才能实现全长复制。当扩增长目的片段（如， >10 kb）时，除了需要增加延伸时间，还需要降低PCR温度，以确保引物结合并在长时间循环中维持酶活性。

图 6.不同延伸时间的PCR结果。使用“快速型”和“缓慢型”DNA聚合酶扩增1.5 kb DNA，证明优化延伸时间有助于提高得率和效率。

为扩增目标DNA，需重复（或“循环”）PCR的变性、退火和延伸步骤多次。循环数通常为25-35次，具体取决于DNA起始量和所需的目标PCR产物得率。如果DNA起始量少于10拷贝数，则可能需要多达40个循环，才可获得足够的得率。不建议使用超过45个循环，因为过多的循环数会产生非特异性条带。而且，副产物的累积和反应组分的消耗会大大降低PCR效率，使PCR扩增曲线出现平台期（图 7）。相反，较少的循环数更适合于无偏倚扩增（如下一代测序）以及目标DNA的准确复制（如克隆）。

最后一个PCR循环完成后，即为最终延伸步骤。该步中，将PCR混合物在延伸温度（通常为72°C）下最后孵育5-15分钟。而其持续时间还取决于扩增子长度和组成，此外应进行优化，以确保全长复制以及高目标DNA片段得率（图 8）。在该步骤中，除了填补不完整末端外， Taq DNA 聚合酶等具有末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）活性的DNA聚合酶还会在PCR引物的3'末端添加额外的核苷酸。因此，如果PCR扩增子被克隆到TA载体中，建议最终的延伸步骤持续30分钟，以确保生成合适的3′-dA尾部结构以实现有效的PCR克隆（了解关于 TA 克隆的更多信息）。

图 8.优化最终延伸步骤后获得的PCR结果。对于该实验中来自人类gDNA的0.7kb、富含GC的PCR片段，增加最终延伸时间可加强其全长 复制和获得高得率。在0分钟时，目标条带下方的拖尾表明DNA聚合酶未将PCR扩增子完全延伸。

1. Breslauer K, Frank R, Blöcker H et al.(1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence.Proc Natl Acad Sci U S A83(11):3746–37450.
2. Rychlik W1, Spencer WJ, Rhoads RE (1990) Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.Nucleic Acids Res18(21):6409–6412.
3. Chester N, Marshak DR (1993) Dimethyl sulfoxide-mediated primer Tm reduction: a method for analyzing the role of renaturation temperature in the polymerase chain reaction.Anal Biochem209(2):284–290.