PCR热循环仪选择--6项关键考虑因素-赛默飞

不同型号和生产厂商的热循环仪（PCR仪）可能会展现出不同的性能和可重复性。这些不同不仅会影响PCR效率也会对获取数据的准确性和一致性造成影响[1-3]。过度使用的热循环仪的可靠性，以及当问题出现时可提供的支持，都是在进行PCR热循环仪选择时需要考虑的重要方面。因此，了解可影响PCR结果的关键参数，掌握如何进行PCR仪器选择，可帮助我们最大程度实现实验的成功。

了解Applied Biosystems PCR仪热点文章

本页内容：

均一的模块温度
精确的温度控制
准确的样品温度

实验通量设计
可靠性和耐久性
质保和服务

1. 加热模块之间准确而一致的温度

PCR热循环仪温度的准确性可能会对PCR的成败与否起决定性作用，因为PCR的三个主要步骤都依赖于温度。类似地，加热模块上孔与孔之间的温度一致性对于获取可靠而可重复的PCR结果也是至关重要的。因此，所使用的PCR热循环仪能在模块之间准确到达设定的温度并具有一致性十分关键。

确保热准确性的一种方法就是经常使用温度验证试剂盒进行检测（图1）并根据需要由接受过培训的专业人士进行重新校准。温度验证检测通常可用于：

在等温模式下相对于设定温度的孔间准确性
在温度转换后相对于设定温度的孔间准确性
热盖温度的准确性（可影响模块和样品温度）

图 1. 使用温度验证试剂盒进行模块和热盖温度的测量视频：验证PCR热循环仪温度精确性的 5 个理由

顶部

2. 用于引物退火优化的精确温度控制

梯度温度控制是PCR热循环仪一项可有助于PCR中引物退火温度优化的功能。梯度设定的目的是在模块之间实现不同温度，通过每列之间≥2°C的间隔温度的增加/降低，使得可同时对于一系列的温度进行测试以获取最佳的引物退火温度（图2A）。

理论上，真正的梯度可在模块之间实现线性的温度（图2B）。然而，梯度PCR仪通常只采用单一的热模块并通过位于两端的两个加热及冷却元件进行温度的控制。该设计经常会导致以下限制[5]：

仅能设置两个温度：在热模块的两端设置成引物退火的最高、最低温度（图2A）。因此，无法在模块间实现其他温度的精准设置。
由于不同列之间的热交换，模块上不同区域之间的温度更可能遵循的是S形的曲线变化而非真正的线性梯度（图2B）。

图 2. 梯度温度设置 (A) 因为加热模块的设计，仅能设置两个温度：在热模块的两端设置成引物退火的最高、最低限温度。两个温度点的设置是基于计算出来的退火温度（T _m）和不同列之间期望实现的温度差。 ( B ) 理论值（真正的梯度） vs. 梯度热模块上实际测量得到的温度。

具有“better-than-gradient（优于传统梯度）”技术的PCR热循环仪可实现更好的引物退火温度控制[5]。该技术的一种形式便是设计带有三个或更多分隔金属模块的热循环仪，每一模块都具有独立的加热和冷却元件。相比于梯度模块，该模块设计可带来：

独立设置三种或更多不同温度的能力，以便使得每个独立的区域都能进行更好的温度控制，特别是在温度优化过程中（图3A）。
独立金属模块的绝热性阻止了模块之间的热传递。这就可实现更为精准的模块温度控制，确保模块之间实现真正线性的温度变化（图3B）。

图 3. (A) 具有Applied Biosystems VeriFlex “better-than-gradient”技术的PCR热循环仪模块可实现更为精准的温度控制。 (B) VeriFlex模块上设置为4°C温度间隔差的6块独立区域的温度测量

顶部

3. 获得准确的样品温度：升降温速度，维持时间及算法

热循环仪对于样品温度控制的能力对于PCR检测结果的准确性和整体性能十分重要。仪器特异性的参数如升降温速度，维持时间以及算法对于预测样品温度（包括模块温度都是准确控制样品温度的关键[6]。

PCR仪的升降温速度意味着在一定时间内发生的PCR步骤之间的温度变化，并通过用摄氏度每秒(°C/sec)作为单位。相应的“升温”和“降温”分别代表着热模块的加热和冷却过程。

由于热量从模块传输至样品需要一定的时间，样品实际的升降温速度会较慢（相对于模块）。因此，对于变温速度的定义需要进行区分和了解（图4）。

最大或峰值模块升降温速度代表在进行升降温过程中非常小的一段时间内模块可以达到的最快温度变化。
平均模块升降温速度代表在一段更长的时间内温度变化的速度，对于PCR热循环仪的速度会提供一种更具代表性的测量。
最大样品升降温速度及平均样品升降温速度反映的是样品实际获得的温度。因此，样品升降温速度会为PCR热循环仪的性能以及其对于PCR结果的潜在影响提供一种更为准确的比较。

由于PCR热循环仪的升降温速度会对PCR结果产生影响，当进行热循环仪更换时，推荐使用带有可模拟之前程序升降温速率的仪器以实现更为简易的更换并对PCR的重复性产生最小的影响。

图 4. 模块和样品的升降温速度 模块的热过冲可让样品更快达到期望的温度。橙色和蓝色散点曲线描绘了在没有模块热过冲的情况下模块和样品的温度。

PCR热循环仪应该被设计成只有样品达到设置的温度后才对相应的步骤开始计时。这样维持时间，或样品维持在设定温度的时间，将会与操作流程中要求的相应循环条件保持得更加准确。

PCR仪通常会使用复杂的数学算法来确保样品可按照预设程序快速地达到设置的温度。[6] 根据反应体系的体积以及所使用的PCR塑料耗材的厚度，算法可对样品的温度以及达到设置温度所需的时间进行预测。依靠这些算法，PCR热循环仪在加热或冷却的过程中，通常会经过一个叫做热模块过冲或下冲的过程让模块温度超出设定值。这样的设置可以确保样品尽快达到设定的温度，而自身不会发生过冲或下冲（图4）。

顶部

4. 满足不同实验通量的灵活性及设计

在一定时间内可以在PCR热循环仪内进行的反应数对于PCR实验的效率十分重要。可提升PCR仪通量的因素包括升降温速度、热模块构造以及自动化平台的整合。

PCR仪的升降温速度代表了其达到设置温度的速度。升降温速度越快，PCR运行的速度就会越快，也就是在一定时间内可以完成更多的实验（图5A）（了解更多：样品升降温速度 vs. 模块升降温速度）。此外，使用可更快合成目标DNA的DNA聚合酶也可对高通量实验进行加速（图5B）[7]。

图 5. PCR热循环仪的升降温速度以及DNA聚合酶的合成速度影响PCR运行时间。 (A) 升降温速度越快，升降温时间越短。在较低的升降温速度（如1–3°C/秒）时，PCR运行时间的影响更为显著。该案例中使用的均为假设值，循环时间指的是操作流程时间。 (B)使用具有更快合成速度的DNA聚合酶将会导致更短的循环时间和PCR运行时间。

PCR仪模块的设计对于PCR实验的设置也至关重要。例如，可替换的模块就可为每轮运行带来样品数量上的灵活性。此外，具有可单独控制的多个模块的加热模块是在一台PCR仪上同时运行不同PCR程序的理想选择（图6）。

对于自动化的高通量PCR，PCR仪应该可编程并兼容控制移液处理系统的软件。自动化系统是进行高通量PCR反应的理想选择，因为其可以在几乎没有人为干预的情况下持续不断地运行，因而将手工实验设置所需的时间最小化，并提高在一定时间内可反应的数量。因此，对于比较简易而灵活的自动化平台进行整合的需求是存在的，从而实现移液处理或板堆叠的完全自动化操作。