PCR仪（热循环仪）教学

PCR 仪或热循环仪是一款通过聚合酶链反应将目标核酸序列扩增为数百万个拷贝的仪器。热循环仪在循环程序中进行温度调节，因此而得名。

热循环仪含有可调节热量的金属模块。由于 PCR 实验程序在不同时间需要不同的温度，因此热循环 PCR 仪在 PCR 运行过程中可调节进行快速热交换。

从 20 世纪 80 年代推出PCR仪开始，到可替换加热模块和 优于传统梯度的技术，一起来探索 PCR 仪的历史及多年来 PCR 技术的发展历程。

PCR是一种用来将目标 DNA 序列扩增至百万拷贝数的常用分子生物学实验技术。在 20 世纪 80 年代早期的技术开始阶段，通过 PCR 所进行的 DNA 扩增是一项耗时且繁琐的过程。热循环的过程通过手工操作的方法而进行，主要是将 DNA 样品在三个设置了不同温度的大型水浴装置之间进行反复的转移，以实现变性、退火和延伸的过程。由于当时尚无具有热稳定的 DNA 聚合酶，所使用的酶在每一轮反应之后都需要进行更换补充。

因此，工程师们开始开发一种一体式的仪器（热循环仪）来实现 PCR 过程的自动化。第一款所开发的自动化仪器，被称为"Mr. Cycle "，通过使用移液处理装置和水浴解决了在每一次循环之后都需要手动添加新鲜酶的需求[1]。在 1987 年，第一款商品化PCR仪，来自 Perkin Elmer Cetus 的 TC1 DNA 热循环仪面世，通过使用金属模块因而具备了对样品进行程序性加热和冷却的能力（图 1）。在 1988 年，在 TC1 热循环仪中第一次使用热稳定性酶（ Taq DNA 聚合酶）的情况被报道[2]。这为将 PCR 应用于十分广泛的科学领域以及为分子生物学研究带来革命的PCR仪创新铺平了道路。

了解 PCR 酶的历史

自 TC1 DNA 热循环仪推出以来， PCR 技术已经取得了显著进展，为改进 PCR 实验提供了多种功能。这些功能包含更精确的 PCR 温度控制，改进的优化功能，更快的升温速率和更简单的程序设置。

a、利用热盖功能可更好地处理样品

在热循环仪开发的早期，冷却系统依赖于大型的管道压缩机，使得仪器的尺寸难以得到缩小。目前，PCR仪中所使用的固定状态的 Peltier 模块可通过控制电流的方向来实现加热和冷却的功能（图2）。更为先进的 Peltier 系统可实现更为快速的（如 ProFlex PCR 系统 每秒 6°C）模块加热和冷却过程，通过 快速 PCR 来一天内完成更多的PCR实验。

类似地，热盖是热循环仪的一种常用功能，用于防止运行过程中 PCR 样品的蒸发和浓缩。在热盖被发明之前，样品会通过矿物油的覆盖来达到同样的目的。除了会造成不方便和脏乱外，矿物油的覆盖限制了可用于下游应用的样品量，因为部分样品将会被遗留下来以防止矿物油的污染。

同样，现如今许多的PCR仪设计都会考虑到样品通量的灵活性。通过可替换的模块，桌面型PCR仪可实现，例如1 到 480000个扩增反应 （图3）。对于高通量的自动化过程，已有一些无需手动操作，可整合自动化移液处理的热循环PCR仪。

图 3.适用于不同通量需求的PCR仪可替换模块例如， ProFlex PCR 系统是可更换模块的PCR仪。该 PCR 仪的可用模块包含 3 x 32 孔， 96 孔，双 96 孔，双 384 孔和双平板模块。

b、更精确和一致的 PCR 优化，以获得更好的结果

由于引物和目标序列之间的退火过程对于成功获取 PCR 结果至关重要，退火温度通常都需要进行优化。为了实现对于不同温度的同时检测，梯度热模块被开发出来，以实现在单一金属模块两端设置接近理论退火温度的高、低温（图4A）。现在有一种 “优于传统梯度” 技术，通过使用绝热的独立热模块来取代单一的模块（图4B）。这可通过更为精准的温度控制来实现更为准确快速的温度梯度优化。

除了模块技术外，用于样品温度控制的算法也得到了提升。复杂的数学模型被运用于更为精准的模块温度调节，以实现PCR样品的一致性加热和冷却。该创新技术不仅对加热模块温度进行测量，还会对于样品自身的温度进行测量。

应用说明：PCR热循环仪：热循环关键概念和变温速率

c、高级珀尔帖（Peltier ）模块可实现更快的升温速率和运行时间

”快速“ PCR 指的是可以显著提升整体 PCR 运行速度的程序方案（图 5），通常可将运行时间从接近 2 小时降低至低于 40 分钟，不仅节省了时间也提高了通量。珀尔帖模块元件（Peltier ）是 PCR 技术发展的一个标志。Peltier 元件的进步提升了运行速度，从而使得升温速率更快，模块和样品更快加热和冷却，以及改进的算法可控制和更好地预测样品温度。

这些仪器上的改进，以及在PCR 耗材和试剂上的创新，如超薄壁低容 PCR 耗材和高度工程改造的 DNA 聚合酶，更为显著地提高了快速 PCR 的性能。

应用说明：PCR仪：热循环关键概念和温度变化速率

D、更简单的 PCR 设置和更高的易用性

如今的PCR仪都可实现 PCR 操作过程的简易编程。PCR 操作程序通常会因为 DNA 靶标、引物序列、所使用的 DNA 聚合酶和实验目的而不同。因此，具有直观用户界面的PCR仪，如带有触屏并可简易编程功能，可实现更为快速和有效的程序设置（图6）。

最近的一些进展也实现了可在任何时间和任何地点对PCR仪进行远程操控使用（通过使用手机或桌面计算机）。与云平台相连为 PCR 程序的创建、分享以及 PCR 运行的预定、起止和监控提供了更高的便捷性和自由度。

总的来说，从 20 世纪 80 年代面世以来，PCR热循环仪在 PCR 技术和设计上都实现了显著的发展。不断的创新将会继续有助于促进 PCR 和分子生物学研究的进展。

了解PCR仪的六大性能以及如何为您的实验室选择合适的 PCR 仪
了解更多有关 PCR 循环中可帮助优化您实验的因素的信息

1. 聚合酶链式反应历史视频集, 1992–1993.Smithsonian Institution Archives.Record Unit 9577. 
2. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ.使用热稳定 DNA 聚合酶对 DNA 进行引物引导的酶扩增。Science.1998 ： 239 (4839) ： 487-491。