TOPO克隆技术

TOPO克隆的关键是DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有限制酶和连接酶特性。 其生物学功能是在复制期间切割并重新连接 DNA。 牛痘病毒拓扑异构酶I可特异性地识别五核苷酸序列5’-(C/T)CCTT-3’，并且可与连接到3´胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团形成共价键。 它切割一条 DNA 链，而使 DNA 解旋。 随后，这种酶重新连接被切割的链，并使自身从 DNA 上释放出来。 为了利用拓扑异构酶的再连接活性，我们提供在每个3´磷酸基团连接有拓扑异构酶 I 的线性化TOPO载体。 这样，载体便能够轻易地将 DNA 序列与配伍末端连接在一起（图 1、2 和 3）。 该连接过程在室温下仅需 5 分钟即可完成。

图3. 利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。