重组酶聚合酶扩增 (RPA)

重组酶聚合酶扩增 (RPA) 是一种灵敏且在较低恒定温度下进行 DNA 扩增的技术，不需要进行热循环。RPA 由两个引物启动，通过重组酶蛋白复合物、单链结合蛋白和链置换 DNA 聚合酶介导完成。RPA 是一种多功能技术，其应用范围覆盖从病原体诊断到下一代测序。其可在 39–42°C 的恒定温度下运行，非常适合在现场环境检测各种病原体。当将反转录酶整合进入反应中，RPA 也可用来检测 RNA 靶标。反转录酶用于在重组酶复合物结合引物以启动 RPA 反应之前，将 RNA 合成 cDNA 模板。扩增的 DNA 可以使用多种方法进行检测，例如终点法检测、实时定量分析、侧流分析和 CRISPR-Cas 系统检测。

Diagram depicting steps in a recombinase polymerase amplification workflow

图1.重组酶聚合酶扩增 (RPA)。 当由 UvsX 和 UvsY 蛋白组成的重组酶复合物在存在 ATP 的情况下与引物结合时，RPA 反应开始。该复合物寻找 DNA 上的同源序列，并促进 DNA 链打开和引物结合。单链 DNA 结合蛋白（Gene 32 Protein）可稳定所形成的 D-环结构，使 DNA 聚合酶能够将引物进行延伸，同时置换 DNA 链。

Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒

Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒包含进行等温重组酶聚合酶扩增 (RPA) 所需的所有组分（无甘油的形式），具有高反应灵敏度、高特异性和高抑制剂耐受性。该试剂盒所有组分以单独包装形式提供，为优化 RPA 反应提供了较大的灵活性，可用于多种病原体 (RNA/DNA) 检测，包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感、麻疹和其他病原体。(RT-)RPA 反应组分也以单独的酶蛋白分别提供。

产品特点：

高灵敏度—可检测低至一个拷贝
高特异性—可在 RNA/DNA 混合物中检测和扩增单个靶标
快速—可在 20 分钟内完成靶标扩增
强劲—甚至可以从含抑制剂的 RNA/DNA 样本中进行靶标扩增
灵活—组分单独包装，为 RPA 或 RT-RPA 反应的优化提供较大灵活性

高灵敏度

Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒的高灵敏度使其可从有限的起始材料或含有低浓度靶标 DNA/RNA 的样品中进行高效扩增。如下图所示，Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒表现出比其他市售 RPA 试剂盒更高的灵敏度。

图2.可从低至 5 拷贝的P. aeruginosa基因组 DNA 中高灵敏且可靠地扩增 238 bp 的靶标。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒或其他等温扩增试剂盒，按照生产商建议，从 0.1 pg–1 ng 的 P. aeruginosa基因组 DNA 中扩增 238 bp 的靶标。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

图3.可从低至 5 拷贝的M. pneumoniae基因组 DNA 中高灵敏且可靠地扩增 386 bp 的靶标。 使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒或其他等温扩增试剂盒，按照生产商建议，从 0.01–100 pg 的 M. pneumoniae基因组 DNA 中扩增 386 bp 的靶标。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

图4.可从低至 0.01 ng 人类基因组 DNA 中高灵敏且可靠地扩增 320 bp 的靶标。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒或其他等温扩增试剂盒，按照生产商建议，从 0.01–100 ng 的人类基因组 DNA 中扩增 320 bp 靶标。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

图 5.从低至 1 拷贝 Adenovirus 41 DNA 中高灵敏且可靠地扩增 161 bp 的靶标。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒或其他等温扩增试剂盒，按照生产商建议，从 1-1,000 拷贝的腺病毒 41 DNA 中扩增 161 bp 靶标。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

RNA sensitivity comparison with 206 bp target

图 6.从低至 1 拷贝 SARS-CoV-2 RNA 中高灵敏且可靠地扩增 206 bp 的靶标。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒（搭配 Invitrogen SuperScript IV 反转录酶、 Invitrogen RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂和 Thermo Scientific RNase H）以及其他等温扩增试剂盒，按照制造商建议，从 1–1,000 拷贝的 SARS-CoV-2 RNA 中扩增 206 bp 靶标。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

RNA sensitivity comparison with 253 bp target

图7.从低至 1 拷贝寨卡病毒 RNA 中高灵敏且可靠地扩增 253 bp 的靶标。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒（搭配 Invitrogen SuperScript IV 反转录酶、Invitrogen RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂和 Thermo Scientific RNase H）以及其他等温扩增试剂盒，按照制造商建议，从 1–1,000 拷贝的寨卡病毒 RNA 中扩增 253 bp 的靶标。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

高特异性

Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒具有高特异性，可用于检测和扩增遗传物质复杂混合物中的单个靶标。其有助于确保检测结果的可靠性，并尽可能降低非特异性产物的风险。

DNA specificity with pool of different DNA templates

图8.不同 DNA 模板混合物中的高靶标特异性。将 5 种不同的 DNA 模板混合，最终浓度为 Adenovirus 41 DNA 1,000 拷贝/反应、S. aureus 基因组 DNA 1 ng/反应、P. aeruginosa 基因组 DNA 1 ng/反应、M. pneumoniae 基因组 DNA 0.1 ng/反应和 10 ng 人类基因组 DNA。使用靶标特异性引物和 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒，将每个靶标从含不同非相关 DNA 分子的模板中进行特异性扩增。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物（Adenovirus 41 DNA 的 161 bp 靶标、S. aureus 基因组 DNA 的 230 bp 靶标、P. aeruginosa 基因组 DNA 的 238 bp 靶标、人类基因组 DNA 的 305 bp 靶标和 M. pneumoniae 基因组 DNA 的 386 bp 靶标）。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

DNA specificity with pool of different RNA templates

图9.不同 RNA 模板混合物中的高靶标特异性。将 5 种不同的 RNA 模板混合，最终浓度为 SARS-CoV-2 RNA 1,000 拷贝/反应、寨卡病毒 RNA 1,000 拷贝/反应、流感 H1N1 RNA 1,000 拷贝/反应、100 倍稀释的纯化基孔肯雅病毒 RNA 和麻疹病毒 RNA 1,000 拷贝/反应。使用靶标特异性引物和 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒（搭配 Invitrogen SuperScript IV 反转录酶、Invitrogen RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂和 Thermo Scientific RNase H），将每个靶标从包含不同非相关 RNA 分子的模板中进行特异性扩增。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物（SARS-CoV-2 RNA 的 192 bp 靶标、寨卡病毒 RNA 的 253 bp 靶标、流感 H1N1 RNA 的 280 bp 靶标、基孔肯雅病毒 RNA 的 313 bp 靶标和麻疹 RNA 的 452 bp 靶标)。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

耐受抑制剂

即使在经过彻底的样品纯化后，RNA 和 DNA 样品的纯度也可能不佳。Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒对来自 RNA/DNA 提取过程或生物样品本身的常见抑制剂具有出色的耐受性。（见表 1）。

表 1.常见的 (RT-)RPA 抑制剂及其来源。

抑制剂	来源
乙醇	样本制备
肝素、血红素、尿素	血液、尿液
腐殖酸、木聚糖	土壤、植物
UTM（通用转运培养基）	使用 UTM 转移的临床标本

High performance in the presence of inhibitors

图10.在存在抑制剂的情况下仍具有出色性能。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒从 10 ng 人类基因组 DNA 中扩增 305 bp 的靶标。在制备的反应混合物中加入相应的抑制剂。在 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶上分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

多重扩增

凭借 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒的高特异性和强劲性能，其可成功进行多重靶标分析，无需进行太多优化。

High specificity in RPA and RT-RPA multiplexing reactions

图11.RPA 和 RT-RPA 多重反应的高特异性。在同一次 RPA 反应中扩增不同 DNA 模板的三个靶标（1 ng 铜绿假单胞菌基因组 DNA 中的 238 bp 靶标，1 ng 人类基因组 DNA 中的 305 bp 靶标和 1 ng 金黄色葡萄球菌基因组 DNA 中的 376 bp 靶标）。在同一个 RT-RPA 反应中针对不同 RNA 模板扩增四个不同靶标（1,000 拷贝 SARS-CoV-2 RNA 的 192 bp 靶标、1,000 拷贝寨卡病毒 RNA 的 253 bp 靶标、100 倍稀释的纯化基孔肯雅病毒 RNA 的 313 bp 靶标和 1,000 拷贝麻疹病毒 RNA 的 452 bp 靶标）。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒（每个引物的最终浓度为 0.1 μM）进行多重反应，并在 42°C 下孵育 25 分钟。对于 RT-RPA 反应，额外搭配使用 Invitrogen SuperScript IV 反转录酶、Invitrogen RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂和 Thermo Scientific RNase H，并在 45°C 下孵育反应 25 分钟。使用 2% E-Gel EX 琼脂糖凝胶分析扩增产物。所使用的分子量标准为 E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder。

实时定量检测

Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒具有多功能性，与多种结果检测方法兼容，包括实时定量检测。实时定量检测可即时监测和分析 RPA 产物。

图12.RT-RPA 实时定量检测。从 10-1,000 拷贝 SARS-CoV-2 RNA 中扩增 192 bp 靶标并重复进行三次。使用 Invitrogen 可冻干 RPA 试剂盒搭配 SuperScript IV 反转录酶、RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂、RNase H 和 5 μM SYTO 9 绿色荧光核酸染料进行实时 RT-RPA 反应，以进行实时检测。

单独的 RPA 蛋白和试剂

Invitrogen 可冻干 T4 UVsX 蛋白

Invitrogen 可冻干 T4 UvsX 蛋白是一种重组酶蛋白，在双链 DNA 断裂修复和复制叉重新启动中发挥重要作用。其在单链 DNA 上形成螺旋组装体，并促进同源 DNA 分子之间的接合分子形成。

结合其辅助蛋白（可冻干 T4 UvsY 和可冻干 T4 Gene 32 蛋白），可冻干 T4 UvsX 蛋白可用于等温重组酶聚合酶扩增反应 (RPA) 以形成重组复合物，从而开始由可冻干 Bst DNA 聚合酶参与的扩增。

Invitrogen 可冻干 T4 UvsX 蛋白是一种无甘油酶，可进行冻干处理并应用于微流控技术中。

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Invitrogen 可冻干 T4 UVsY 蛋白

Invitrogen 可冻干 T4 UvsY 蛋白是一种重组中介蛋白，其能够提高 T4 UvsX 重组酶催化链交换和同源重组的能力。

Invitrogen 可冻干 T4 UvsY 蛋白是一种无甘油酶，可进行冻干处理并应用于微流控技术中。

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Invitrogen 可冻干 T4 Gene 32 蛋白

Invitrogen 可冻干 T4 Gene 32 蛋白（也称为单链 DNA 结合蛋白）可用于许多常用的分子生物学实验中，如 PCR、克隆和等温扩增（如重组酶聚合酶扩增反应 [RPA]），其可稳定 D-环结构，使 DNA 聚合酶能够延伸引物，置换 DNA 链。

Invitrogen 可冻干 T4 Gene 32 蛋白是一种无甘油酶，可进行冻干处理并应用于微流控技术中。

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Invitrogen 可冻干 Bst DNA 聚合酶

Invitrogen 可冻干 Bst DNA 聚合酶是 Bst DNA 聚合酶大片段的独有突变体，该突变体表现出更快的速度、更强的链置换活性以及对抑制剂的高耐受性。在 RPA 中，可冻干 Bst DNA 聚合酶可扩增由可冻干 T4 UVsX 蛋白及其辅助蛋白（可冻干 T4 UVsY 和可冻干 T4 Gene 32 蛋白）形成的重组复合物。

Invitrogen 可冻干 Bst DNA 聚合酶是一种无甘油酶，可进行冻干处理并应用于微流控技术中。

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