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沉降法是免疫共沉淀 (Co-IP) 的延伸,用于捕获和分离靶蛋白(即抗原)及其相关配体。基于标签的 IP 和沉降策略通过利用生物素化 His、GST、c-Myc 或 HA 标签诱饵蛋白的亲和树脂,使用"诱饵"蛋白而非抗体来捕获蛋白质相互作用靶标。
Pierce 生物素化蛋白相互作用沉降试剂盒 | EZ-Link 脱硫生物素化和沉降试剂盒 | Pierce c-Myc 标签 IP/Co-IP 试剂盒 | Pierce HA 标签 IP/Co-IP 剂盒 | Pierce GST 蛋白相互作用沉降试剂盒 | Pierce His 蛋白相互作用沉降试剂盒 | |
靶标 | 生物素化蛋白 | 生物素化蛋白 | c-Myc 标签重组蛋白 | HA 标签重组蛋白 | GST 标签重组蛋白 | His 标签重组蛋白 |
基础微珠 | 链霉素亲和素琼脂糖树脂 | 高容量链霉素亲和素琼脂糖树脂 | 抗 c-Myc 琼脂糖树脂 | 抗 HA 琼脂糖 | 谷胱甘肽琼脂糖 | 钴螯合物琼脂糖树脂 |
结合容量 | 1–3 mg/mL | >10 mg/mL | 102 nmol/mL | >60 nmol/mL | 8–10 mg/mL | 10–25 mg/mL |
非特异性结合 | 低 | 低 | 更低 | 更低 | 最低 | 最低 |
洗脱条件 | 低 pH (2.8) 缓冲液 | 中等(游离生物素缓冲液) | 低 pH (2.0) 缓冲液 | 非还原样本缓冲液 | 100 mM 还原型谷胱甘肽 | 250 mM 咪唑溶液 |
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采用 Thermo Scientific Pierce HA IP/Co-IP 试剂盒和 c-Myc IP/Co-IP 试剂盒获得 IP 结果,分别应用了适当的阳性对照裂解液提供并推荐的 GST-HA 和 GST-c-Myc 洗脱选项。每个试剂盒均提供了洗脱组分。用洗脱缓冲液执行洗脱 #1;用 2X 非还原样本缓冲液执行洗脱 #2。
泳道编号 | A. GST 标签沉降 | B. PolyHis 标签沉降 |
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1 | 表达 GST 标签 BIR2(诱饵蛋白)的大肠杆菌裂解液。 | 表达 9xHis 标签野生型 Smac(诱饵蛋白)的大肠杆菌裂解液。 |
2 | 来自泳道1中裂解液的流穿液在 4°C 下与固定化还原型谷胱甘肽载体结合1小时。 | 来自泳道1中裂解液的流穿液在 4°C 下与固定化钴螯合物载体结合1小时。 |
3 | 载体洗涤 #1。 | 载体洗涤 #1。 |
4 | 载体洗涤 #2。(未显示洗涤 3-5。) | 载体洗涤 #2。(未显示洗涤 3-5。) |
5 | 表达 9xHis 标签野生型 Smac(猎物蛋白)的大肠杆菌裂解液。 | 表达 GST 标签 BIR2(猎物蛋白)的大肠杆菌裂解液。 |
6 | 来自泳道5中裂解液的流穿液在 4°C 下与固定化诱饵蛋白相互作用1小时。 | 来自泳道5中裂解液的流穿液在 4°C 下与固定化诱饵蛋白相互作用1小时。 |
7 | 载体洗涤 #1。 | 载体洗涤 #1。 |
8 | 载体洗涤 #2。(未显示洗涤 3-5。) | 载体洗涤 #2。(未显示洗涤 3-5。) |
9 | 诱饵蛋白对照。按照泳道 1-8 中所述操作处理诱饵蛋白,随后洗脱。未添加猎物蛋白,仅添加结合缓冲液。 | 诱饵蛋白对照。按照泳道 1-8 中所述操作处理诱饵蛋白,随后洗脱。未添加猎物蛋白,仅添加结合缓冲液。 |
10 | 猎物蛋白对照。按照泳道 1-8 中所述操作处理猎物蛋白,随后洗脱。未添加诱饵蛋白,仅添加结合缓冲液。 | 猎物蛋白对照。按照泳道 1-8 中所述操作处理猎物蛋白,随后洗脱。未添加诱饵蛋白,仅添加结合缓冲液。 |
11 | 使用 100 mM 还原型谷胱甘肽从载体中洗脱诱饵蛋白:猎物蛋白复合物(在泳道 1-8 中制备)。蛋白质免疫印迹法确认在泳道9和11中观察到的次要谱带是 GST 标签 BIR2 的降解产物。 | 使用 250 mM 咪唑从载体中洗脱诱饵蛋白:猎物蛋白复合物(在泳道 1-8 中制备)。 |
仅供科研使用,不可用于诊断目的。