Thermo Scientific 一步法 IVT 系统使用入门

在开发过程中，我们的研发科学工作者在使用 Thermo Scientific 人 体外 翻译系统表达 100 种不同蛋白时，成功率达 95%。本概述重点介绍使用 DNA（表达载体或 PCR 扩增子）或 mRNA（体外 转录反应）模板确保您独特的 体外 翻译实验获得极佳结果和表达水平的关键步骤。

准备体外翻译实验用的基因，首先要确定成功生成蛋白的恰当元件。尽管研究人员可以从开放阅读框集合中找到某个基因，从细胞或质粒进行 PCR 扩增，但这些编码序列通常无法实现较佳的人体外表达。下一小节将介绍必须位于编码序列侧翼以确保 mRNA 转录本稳定性和翻译效率达到优异水平的关键元件。这些元件可通过将目标基因克隆到我们推荐的表达载体（包含在所有 Pierce 人体外蛋白表达试剂盒中）或通过 PCR 添加必要的元件来引入。

人 体外 翻译系统针对使用克隆到 Thermo Scientific pT7CFE1 表达载体的 cDNA 进行了优化。以下是该载体中关键元件（尤其是 IRES 元件）的说明，其可在我们的人无细胞系统中实现高效的 体外翻译。

RNA 聚合酶启动子

相较于源自细菌或高等生物的多亚基 RNA 聚合酶，噬菌体 RNA 聚合酶更适用于快速、重复的转录。单体噬菌体 RNA 聚合酶效率高、结构相对简单，因而非常适用于 体外 转录反应。鉴于此，选择 T7 噬菌体 RNA 聚合酶用于人 IVT 系统中的转录。因此，使用人 体外 表达系统进行 体外 转录反应时，需要在编码序列的上游插入 T7 RNA 聚合酶启动子元件以生成 mRNA。pT7CFE1-CHis 表达载体（包含在人 IVT 试剂盒内）具有 T7 RNA 聚合酶启动子，其与转录反应混合物中的 T7 RNA 聚合酶共同发挥作用。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，T7 RNA 聚合酶启动子序列（核苷酸 1-18）为 5'-taatacgactcactatag-3’

转录终止子

据转录机制，含有转录终止子的序列标记基因的末端。在 mRNA 编码区或环状质粒模板末端后面有非常长的非编码序列的情况下，该元件极其重要。除了产生长度更均匀且稳定性更强的 mRNA 之外，终止子序列还有助于保留用于合成编码序列的转录反应材料 (NTP)。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，T7 终止子序列（核苷酸 700-747）为 5'-tagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg-3’

IRES（高产核糖体结合序列）

所有体内真核 mRNA 都具有一个 5' 帽结构，该结构包含一个通过 5'-5' 三磷酸盐桥连接到 mRNA 的第一个核苷酸的 7-甲基鸟苷 (m7G)。5' 帽可通过防止转录本的外切酶降解，促进高效翻译并延长 mRNA 的半衰期。

或者，脑心肌炎病毒 (EMCV) 的内部核糖体进入位点 (IRES) 可以代替 5’ 帽。IRES 元件独特的二级结构可十分有效地将核糖体募集到 mRNA 并启动翻译。没有 5' 帽时，该属性可从含有 IRES 元件的 mRNA 实现极高水平的蛋白表达。使用 pT7CFE1-CHis 表达载体转录的所有 T7 RNA 聚合酶 mRNA 将具有 IRES 元件，以便与人 IVT 系统一起使用时实现优异的表达水平。

关于 IRES 元件的重要说明： 一步法人 IVT 试剂盒可与 DNA 或 RNA 模板搭配使用。如果您已经从其他表达载体中生产出不含 IRES 元件的 mRNA，则蛋白质产量将大大降低。您可以通过给 mRNA 加帽来提高稳定性和翻译效率。目前市面上已有用于 体外给 mRNA 加帽的试剂盒，但与使用 IRES 元件相比，加 5’ 帽的 mRNA 的表达水平仍将大大降低。没有 IRES 元件或 5' 帽的情况下， 体外 翻译可能会失败（参见数据）。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，EMCV IRES 序列包含核苷酸 33 至 535

Kozak 序列

在真核 mRNA 中发现的 Kozak 共有序列 [(gcc)gccRccAUGG] 在翻译启动过程中发挥主要作用。在从 pT7CFE1-CHis 转录的 mRNA 中，IRES 元件作为核糖体结合位点发挥作用，而 Kozak 序列有助于将核糖体定向至正确的 ATG 密码子以启动翻译。原核 Shine-Dalgarno 序列在真核 体外翻译系统中不起作用。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，Kozak 序列（核苷酸 524-536）为 5'-gatgatAatATGG-3’

融合标签

亲和标签可以极大地简化需要纯化重组蛋白的应用。为辅助这些应用，pT7CFE1-CHis 包含一个 C 端组氨酸标签，用于促进全长重组蛋白的纯化和检测。对于不含组氨酸标签的蛋白表达，请确保终止密码子正好位于 cDNA 的最后一个氨基酸密码子后面。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，6xHis 编码序列（核苷酸 611-628）为 5'-caccaccaccaccaccac-3’

聚腺苷尾部结构

在真核 mRNA 的 3' 端处的聚腺苷尾部结构（poly(A) 尾）是添加在翻译终止密码子下游的多达 200-300 个腺苷核糖核苷酸的延伸段。（例外：组蛋白 mRNA 的 3' 端具有茎环结构加上一个富含嘌呤的序列，而不是 poly(A) 尾）。已知聚腺苷酸化可以保护 mRNA 免受酶降解，同时也有助于翻译。在 mRNA 的 3' 端延伸 30 个腺苷核糖核苷酸足以稳定 体外 翻译的转录本。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，poly(A) 尾序列（核苷酸 642-671）为 5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’

克隆到 pT7CFE1-CHis 表达载体

pT7CFE1-CHis 表达载体经过优化，可在人 体外翻译系统中用于表达，因为它具有所有的适当元件。多克隆位点具有 11 个独特的限制性内切酶位点，可选择 cDNA 序列中未发现的位点。为确保正确翻译，应确保您的克隆 cDNA 与位于 Msc1 限制性内切酶位点上游的"ATG"起始密码子在同一阅读框中。pT7CFE-CHis 载体还包含一个 C 端 6X 组氨酸标签，可辅助纯化。如果在最终产物中没有 C 端组氨酸标记，则"AUG"终止密码子应位于 cDNA 的编码序列后面，以便正确终止翻译。

注： 在 pT7CFE1-CHis 中，多克隆位点（核苷酸 550-610）序列为 5'-tggccaccacccatatgggatccgaattcgatatcttaatt
aagctgcaggagctcgtcgacgcggccgcactcgag-3'

注：在 pT7CFE1-CHis 中，6xHis 编码序列（核苷酸 629-631）后的终止密码子为 5'-tga-3'

通过 PCR 添加恰当的转录和翻译元件

当不使用 pT7CFE-CHis 或具有相同必需元件的表达载体时，仍然可以通过 PCR（添加链接至 PCR 技术提示）将适当的转录和翻译元件添加到 cDNA 以进行 体外 蛋白表达。下方介绍的两步法 PCR 实验方案让研究人员可在蛋白表达前跳过克隆并获得高蛋白得率。该方法适用于将任何质粒或起始模板用作开放阅读框的程序。

通过该 PCR 方法添加至基因的上游元件包括 T7 启动子、IRES 元件和 Kozak 序列。为了提高 mRNA 的稳定性，还可以将 poly(A) 序列 (21nt) 添加到 cDNA 的 3' 端。PCR 产物可以纯化或者直接用于转录。然后，可以将转录产生的 mRNA 添加到具有所有蛋白表达机制的翻译反应混合物中。

执行上述步骤的示例方案参见可下载的技术提示 (Tech Tip #72)。

每个人偶联 IVT 试剂盒都配有阳性对照载体，可帮助您监测程序的成功状态。所包含的对照品为 Turbo 绿色荧光蛋白 (tGFP) 或 tGFP mRNA 的表达载体（分别包含在 DNA 或 RNA 表达试剂盒中）。对于两种类型的表达试剂盒，均可同时进行 GFP 表达反应和您所需的蛋白样本制备。可定性（目视检查）或定量（光谱检测）评估 GFP 阳性对照品的成功表达。

目视检查

可在反应微量离心管中直接目视检查 25µL GFP 翻译反应。由于人 体外 翻译系统的组分不会淬灭荧光信号，因而在检测荧光前无需执行清理步骤。这种方法不适用于兔网织红细胞裂解物，因为其会淬灭荧光信号。利用配备 FITC 滤光片（激发/发射：482nm/512nm）的显微镜或凝胶成像仪进行 GFP 荧光检测。

光谱检测

如需计算 GFP 阳性对照蛋白表达产出，则使用重组 GFP（部件号 88899）创建标准曲线。为此，将 PBS 中的重组 GFP 设置为连续稀释，范围从 0.40µg/mL 到 50µg/mL。在配备 FITC 滤光片（激发/发射：482nm/512nm）的荧光微孔板读数仪上，读取 96- 或 384-孔板形式的样本。测定 GFP 标准品（已知浓度）和 GFP 翻译反应（未知浓度）的荧光信号，以确定蛋白表达产出 (µg/mL)。绘制标准曲线结果并推断未知 GFP 翻译对照品的结果。90 分钟翻译反应的典型 GFP 表达水平约为 25µg/mL。