人体外转录系统概述

步法人体外翻译（IVT）试剂盒

1步法人IVT试剂盒使用人类细胞裂解物合成蛋白质。相对细菌（大肠杆菌）或者其他（如昆虫、小麦胚芽和兔网织红细胞裂解物）系统，体外蛋白表达使用人类细胞提取物，能够在数小时内生成功能性蛋白质。使用DNA或mRNA模板都能实现表达，模板可以来自载体，或者通过我们的基因开放阅读框架库获得。

体外蛋白表达的优点包括与微升级规模反应的相容性，以及相对于传统基于细胞方法的速度（细菌培养需要过夜，杆状病毒蛋白质制备需要数周）。这种小规模表达方法可以很容易在微孔板中同时表达大量突变变异，或者为未来的实验表达大数量的单一蛋白质。小规模合成也能帮助避免蛋白质聚集成包涵体，这是细菌表达系统的典型问题。此外，体外表达蛋白质也能合成无法在活细胞中生产的毒性蛋白质。此蛋白质表达系统可以表达来自任何物种的蛋白质，并且已经在许多来源原核和真核的基因中得到验证。

亮点：

• 功能性 – 使用人类翻译机制来表达活性蛋白质
• 使用方便 – 在同一步骤中进行转录和翻译
• 高性能 – 与兔网织红细胞体外翻译相比更高产量
• 可靠 – 可以表达的在兔网织红细胞系统无法表达的蛋白质

优于传统方法：

• 不含细胞的海拉细胞提取物能够表达带有翻译后修饰的蛋白质
• 准确翻译获得全长蛋白质，与下游应用兼容
• 蛋白质翻译经过EMCV IRES元件和其他mRNA稳定化元件优化

酶活性和蛋白质相互作用的蛋白质功能分析可能有一些障碍。例如，缺少好的抗体可能造成在免疫共沉淀和电超迁移率实验中，无法识别和验证复杂样品中的蛋白质。在某些特定检测中，低表达水平可能会对富集目标蛋白质的能力造成负面影响。这些问题能够通过使用体外表达蛋白克服，但很多无细胞蛋白表达系统缺乏产生高水平的功能性蛋白的能力和保真性。对于恰当翻译后修饰至关重要的真核蛋白质，这个问题非常复杂。

蛋白质相互作用和人类IVT系统

了解蛋白质功能经常需要检测它和其他生物分子间如何相互作用，比如DNA、RNA和其他蛋白质。蛋白质-核酸（DNA或RNA）相互作用可以通过电泳迁移位移试验（EMSA）监测，以助于阐明从细胞复制到凋亡的调控机制。蛋白质-蛋白质相互作用可通过免疫共沉淀和下拉实分析，有助于识别新型结合伙伴。

对于蛋白质相互作用检测，体外翻译蛋白质免于从活细胞提取蛋白质，并且有助于快速高效地筛选多种蛋白质同种型或变异的能力。下面是一些使用人类IVT系统生成的重组蛋白用于蛋白质相互作用检测的例子。

体外翻译实验对于生成用于高通量突变分析或小分子筛选的蛋白质，非常理想。这些检测通常需要浓缩的纳克到微克级的蛋白质，用于在多孔板中进行分析。人类IVT系统反应可以缩小规模，用于96孔板（标准25µL反应容量）或384孔板（10µL反应容量），不会损失蛋白质/mL相对产出。这个特点使得用户可以直接在多孔板中进行PCR介导的突变分析（参见PCR实验方案），以及快速筛选由体外翻译生成的蛋白质突变库。

对于小分子筛选，体外翻译可以在多个微孔中表达同一种蛋白质，然后使用不同小分子处理，如下面所示，使用已知蛋白质翻译抑制剂。

示例：caspase-3表达和功能

传统的体外翻译系统对可生成的蛋白质类型有限制，因为它们基于细菌、昆虫或其他非哺乳动物来源的无细胞提取物，需要添加异位成分。人类体外转译系统使用的是人类 HeLa 细胞提取物，它内源含有蛋白质合成和适当翻译后修饰所需的酶。因此，使用人类 IVT 试剂盒可以表达多种类型的蛋白质。

传统体外翻译系统在可以生产的蛋白质类型方面有局限性，因为它们是基于细菌、昆虫或其他非哺乳生物来源的无细胞提取物，需要添加外来元素。人类IVT系统使用人类海拉细胞提取物，其内源性地包含蛋白质合成和恰当翻译后修饰所需的酶。因此，许多蛋白质类型都可以使用人类IVT试剂盒表达。

表达广泛分子量范围的蛋白质

蛋白质的稳定性、折叠和溶解性都能影响其成功表达。高分子量蛋白质难以在体外表达，因为其有更大的几率出现过早终止，以及相对于较小蛋白质更复杂的三级结构，这会提高不正确折叠的概率[1,2]。此外，更大尺寸的蛋白质拥有较大疏水区，在E. coli提取物中表达时，会促进包涵体的形成。一步法人体外翻译系统可以用于生产尺寸范围广泛的蛋白质。

表达磷酸化蛋白

一步法人IVT系统使用海拉细胞裂解物进行无细胞蛋白质表达。使用基于人类的系统能够获得与天然蛋白质翻译后修饰方面一致的蛋白质， 从而获得表现天然蛋向质功能和结构的蛋白质。激酶免疫印迹检测显示，人IVT系统表达了一种蛋白质，但总蛋白质检测不能显示这种蛋白功能正常。因此功能性的指示，三种激酶（Aurora A、ERK1和Akt）的磷酸化状态也使用磷特异性抗体Western blot进行验证。体外翻译Akt的磷酸化状态在尺寸上，与在源于血小板的生长因子（PDGF）活化的NIH3T3成纤维细胞中一致，这说明人类IVT系统能够生产与体内功能上类似的激酶。

表达糖蛋白

采用最广泛的体外翻译方法是兔网织红细胞裂解物[3]。虽然这个策略能够进行不依赖5'端帽的翻译，但如果不加入犬微粒体膜，初生蛋白的翻译后修饰如N-糖基化就无法出现，微粒体膜是细胞破裂后形成的囊泡状内质网（ER）残余。虽然兔网织红细胞裂解物和微粒体膜能够生产糖基化蛋白，但这种方法严重减少了蛋白质产量。

我们为您提供一步法人偶联IVT试剂盒标准方案的改编方案，优化表达N-糖基化蛋白质。

表达膜蛋白

膜蛋白通常最难纯化，因为它们的疏水性跨膜区域能够造成大量体外翻译蛋白聚集和沉淀。但是使用人类体外翻译系统合成具有不同数量跨膜区域的膜蛋白，包括疏水GypB/E、类线粒体外膜Bcl2蛋白Bcl2L1和趋化因子受体CXCR4。此外，几乎所有蛋白质都存在于可溶性部分而非沉淀物内，说明合成的膜蛋白没有聚集和沉淀在溶液之外。

一步法人体外翻译系统中使用的较慢的氨基酸添加以及膜富集的海拉提取物，被认为有助于强化蛋白质折叠和膜蛋白的可溶性。此外，微克级水平的蛋白质表达也被认为可以阻止初生蛋白浓度增长超过一个阈值，促进聚集影响细菌表达。使用大肠杆菌提取物的其他系统通常拥有高的多的氨基酸添加率，更高的蛋白质产量，但是较低的膜蛋白浓度，因为降低了折叠效率所以提高了蛋白质聚集的几率[6，7]。类似的，获得毫克规模数量膜蛋白的体内表达方法，经常会导致包涵体的产生，这占有时间，并难降解成可溶性蛋白的蛋白质聚集物。

同一反应中多种蛋白共表达

进行不同蛋白质的共表达，可以用于检测由于突变分析或小分子处理造成的结合亲和力改变，一步法人类IVT系统可以在单一翻译反应中共表达多种蛋白质。使用人类体外表达系统，一次反应中曾表达多达五种HA标记的蛋白质。