二维 (2D) 凝胶电泳是一种从生物样本中分离和分析蛋白混合物的强大且灵敏的技术。2D 凝胶电泳分两个连续步骤进行：IEF 和 SDS-PAGE。

样本制备

样本制备是 2D 凝胶电泳中的关键步骤，是实验成功的关键。许多因素在设计样本制备程序方面发挥着重要作用。我们提供的产品可帮助您取得成功，包括：

2D 电泳样本再水化缓冲液

2D 电泳样本再水化缓冲液（也称为样本缓冲液）用于变性和溶解蛋白样本，以及再水化 IPG 胶条。样本制备的第一步是选择和/或制备合适的样本再水化缓冲液。由于蛋白种类繁多，因此不存在通用的样本再水化缓冲液。实验的起始材料和目的是选择缓冲液时需要考虑的两个因素。样本再水化缓冲液必须：

  • 在 IPG 胶条再水化和 IEF 过程中维持溶液中的蛋白
  • 对蛋白的 pI 没有影响

缓冲液通常含有变性剂（尿素或尿素/硫脲）、增溶剂（非离子或两性离子去污剂和两性电解质）以及还原剂 (DTT)。下表列出了样本再水化缓冲液的主要成分、其功能和推荐浓度。请注意，必须根据蛋白的溶解度对最终浓度进行优化。通常通过改变去污剂、尿素、两性电解质和还原剂的浓度来实现优化。

2D 电泳再水化缓冲液成分

成分功能最终浓度备注
尿素使蛋白变性和溶解
  • 8 M 尿素，或在某些情况下为 9 M 尿素
  • 对于尿素/硫脲溶液，使用 5–8 M 尿素和 2 M 硫脲
  • 尿素溶液新鲜制备或在 –20oC 下冷冻储存。
  • 按照生产商的建议，使用混合床离子交换树脂对尿素溶液进行去离子处理。
  • 硫脲用于提高某些蛋白的溶解度（Rabilloud，1998）
去污剂溶解蛋白，并有助于在再水化和 IEF 过程中维持溶液中的蛋白去污剂总浓度范围为 0.5–4%
  • 使用非离子或两性离子去污剂，如 CHAPS、NP-40、CHAPSO 和硫代甜菜碱 (SB3-10)（Chevallet 等人，1998）。
  • 不推荐使用离子型去污剂，如 SDS。
还原剂切割蛋白中的二硫键20 mM 至 100 mM 的 DTT 或 DTE
  • 使用 DTT 或 DTE（二硫赤藓糖醇）。
  • 不建议使用 β-巯基乙醇进行还原（Righetti 等人，1982）。
两性电解质帮助溶解蛋白并有助于维持 0.2–2% 的 pH 梯度备注：更高的两性电解质浓度需要更长的聚焦时间。
  • 根据 IPG 胶条的 pH 值范围，使用适当的载体两性电解质。
  • 对于 IPG 胶条的所有 pH 值范围，可使用 pH 3–10 的两性电解质。

载体两性电解质与 IPG 胶条的使用比较

载体两性电解质

IEF 使用载体两性电解质在管装凝胶（灌注在长玻璃管中的聚丙烯酰胺凝胶）内执行。将蛋白样本上样至凝胶上，并在高电压下进行 IEF。施加电流后，载体两性电解质形成连续的 pH 梯度。形成梯度时，蛋白在 pH 梯度中迁移至其 pI。

在 IEF 结束时，从管中挤出凝胶，并在含 SDS 的缓冲液中平衡，以制备迁移至二维 SDS 凝胶中的蛋白。将管装凝胶放在含 SDS 的聚丙烯酰胺凝胶上并进行 SDS-PAGE。

载体两性电解质的缺点
使用载体两性电解质执行 IEF 的主要缺点是：

  • pH 梯度易受阴极漂移影响（Rightti，1983）
  • 由于两性电解质的批间差异导致 IEF 分离的重现性较差
  • 由于载体两性电解质与蛋白结合而改变了蛋白迁移率
  • 管装凝胶的机械强度低，导致凝胶破损

IPG 胶条

使用固定化 pH 梯度 (IPG) 凝胶进行一维 IEF，可消除与载体两性电解质相关的问题。固定化 pH 梯度 (IPG) 凝胶是通过在塑料背衬上使用丙烯酰胺缓冲液（含带电基团的丙烯酰胺衍生物）灌制聚丙烯酰胺凝胶而形成。由于是将 pH 梯度灌注到凝胶中，因此梯度更稳定且可重现。IPG 凝胶聚合后，对其进行洗涤、干燥，然后切割成窄带（IPG 胶条）。

IPG 胶条上的 pH 梯度可以呈线性或非线性 (NL)。非线性梯度通常从 pH 4-7 扩展而来，最终形成 S 形 pH 梯度。非线性 IPG 胶条可用于分析包含 pI 4-7 范围内多种蛋白的样本，这是所有物种中大多数粗裂解物的典型样本。

IPG 胶条的优点
使用 IPG 胶条进行一维 IEF 的优点如下：

  • pH 梯度更加稳定且可重现
  • 减少阴极漂移
  • 由于 IPG 胶条灌注在塑料背衬上，因此其机械强度更高，可较大限度地减少凝胶破损
  • 样本上样方法可实现更高的蛋白载量

2D 电泳缓冲液和聚焦缓冲液

2D 电泳系统的另一个关键组分是电泳缓冲液和聚焦缓冲液。我们提供便利可靠的解决方案，可实现更高的性能。

技术资源

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