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2D 凝胶电泳
双向电泳 (2DE) 是一项成熟技术，用于复杂蛋白质混合物的高分辨率图谱分析。双向电泳可以在单块凝胶上分辨数千个蛋白质“点”，是蛋白质组学研究的关键方法。这项技术广泛应用于蛋白质表达图谱分析实验，可以识别由疾病状态或药物治疗引起的蛋白质表达水平的变化。双向电泳也是研究翻译后修饰和鉴定蛋白质异构体的重要工具。蛋白质质量或等电点 (pI) 的微小变化可转化为可检测的蛋白层面变换。
2D 电泳由两个步骤组成。在第一向分离中，蛋白质通过等电聚焦 (IEF) 电泳，根据其等电点 (pI)（即蛋白质净电荷为零时的 pH 值）进行分离。在常规 IEF 中，蛋白质等两性分子进行迁移，直到到达基质 pH 值与其等电点相匹配的区域，在此“聚焦”成清晰的条带。
Novex IEF 凝胶可用于测定 pI 或检测由于脱氨、磷酸化或糖基化作用引起的蛋白质的微小变化。该凝胶也非常适合分析可溶性蛋白质的天然非变性应用。
固相 pH 梯度 (IPG) 胶条代表了技术的进步。在使用样品前，凝胶中产生固相 pH 梯度，提高了分辨率和再现性。第二向分离由常规 SDS-PAGE 电泳分离组成，其中蛋白质根据其分子量进行区分。双向电泳是一种稳健的方法，第二向分离结果可保留第一向分离中的分辨率。
ZOOM IPGRunner 系统
使用传统双向电泳法分析复杂蛋白质样品既枯燥又耗时。ZOOM IPGRunner 系统提供包括小型蛋白预制胶在内的整体解决方案。这种创新系统为蛋白质组学研究新手和资深研究人员提供了灵敏的蛋白表达谱分析方法。ZOOM IPGRunner 系统的设置与实验操作都更为简单快速，无需覆盖矿物油，是一种性价比高且省时的解决方案，用于在运行大型 2D 凝胶分析前建立初始实验条件。
您可以快速、轻松获得高分辨率结果。ZOOM IPGRunner 系统具有：
- 不到 3 小时完成第一向分离
- 设计独特，无需繁琐的矿物油覆盖步骤
- 一个单位宽/窄 pH 范围内易于处理的 IPG 胶条
- 简化再水化和聚焦处理的独立卡盒
- 高性能 NuPage Bis-Tris 凝胶为第二向分离提供中性 pH 环境，减少凝胶内蛋白质降解。
- 2D 电泳所需的所有组件和试剂见第一向和第二向 迎新套装 包括 PowerEase Touch HV 触屏高压电源。仅需添加您选择的 IPG 胶条和两性电解质
样品制备
样品制备是所有蛋白质分析工作流程中的基本步骤，但在没有通用方法的 2D 电泳中更为关键。缓冲液通常含有变性剂、尿素或尿素与硫脲的混合物、非离子去污剂或两性离子去污剂、裂解二硫键的还原剂和两性电解质。配制增溶缓冲液的目的是为了达到最佳的蛋白质增溶作用，防止在支持 IPG 胶条的凝胶的水化过程中发生沉淀。盐、离子型分子和离子去垢剂干扰等电聚焦，影响蛋白质分离。下表列出了样品制备的常用试剂。每种组分的浓度需要通过实验确定，实验条件需要优化。这可以通过 ZOOM IPGRunner 系统轻松、快速实现。
| 组分 | 功能 | 浓度 |
|---|---|---|
| 用于膜蛋白的尿素或尿素/硫脲 | 蛋白变性和增溶 | 8 M 或 9 M 尿素或 5–8 M 尿素，含 2 M 硫脲 |
| 非离子去垢剂（CHAPS、CHAPSO、NP-40） | 蛋白增溶和稳定 | 0.5-4% |
| DTT 或 DTE | 还原二硫键 | 20 mM–100 mM |
| 两性电解质 | 帮助蛋白质增溶，维持 pH 梯度 | 0.2-2% |
第一向
ZOOM IPGRunner 系统是一个无需矿物油的平台，可在 3 小时内对多达 12 份样品进行等电聚焦。7 cm ZOOM 胶条是固相化 pH 梯度 (IPG) 凝胶条带，浇铸在塑料支架上。这些胶条可提供用于宽范围分析的宽 pH 梯度形式（3–10、4–7、6–10），以及用于在特定目标区域进行深度蛋白分离的窄 pH 梯度形式（4.5–5.5、5.3–6.3、6.1–7.1）。
范围重叠的 ZOOM IPG 条带有 8 种类型：
| 范围广： | 中范围： | 窄范围： |
|---|---|---|
| pH 3–10 非线性 | pH 6–10 | pH 4.5–5.5 |
| pH 3–10 线性 | pH 9–12 | pH 5.3–6.3 |
| pH 4–7 | pH 6.1–7.1 |
pH 宽范围 IPG 胶条可分离单块凝胶中的大部分蛋白质。非线性 pH 梯度通过扩大凝胶中间的 pH 范围和压缩梯度酸性端和碱性端的 pH 值，提高了大部分蛋白质可能聚焦的 pH 范围中间的蛋白质分辨率。一个单位 pH 范围 IPG 胶条可以简单地“分级分离”样品并提高凝胶分辨能力。在整个凝胶长度上，只分辨出一小部分蛋白质，这可以增加上样量，进而检测更多的蛋白质点。通过运行 pH 范围重叠的 IPG 胶条，提高了整体的分离分辨率，可分析更多蛋白质，无需耗时且影响再现性的样品分级分离步骤。
下表为蛋白上样量建议。
| IPG pH 范围 | 考马斯染色 | 银染 | 上样量 |
|---|---|---|---|
| 宽范围 (3–10 L, NL) | 20–50 μg | 5–15 μg | 过夜水化需 140 μl 或 155 μl |
| 中范围 (6–10, 9–12, 4–7) | 100–200 μg | 50–100 μg | 过夜水化需 140 μl 或 155 μl |
| 窄范围（4.5–5.5、5.3–6.3、6.1–7.1） | 最多 400 μg | 最多 200 μg | 过夜水化需 140 μl 或 155 μl |
ZOOM 载体两性电解质是一种可溶性小分子，带有正负电荷团，基于等电场在其相对位置上进行排序，形成 pH 梯度。载体两性电解质有助于稳定 IPG 胶条中的 pH 梯度和电流，提高蛋白质溶解度，从而提高 IEF 分辨率的再现性。
第二向
等电聚焦后，使用 NuPAGE LDS 样品缓冲液还原、烷基化及平衡 ZOOM 条带。平衡后的 ZOOM IPG 胶条可轻松放入 NuPAGE 凝胶，根据分子量对蛋白质进行二维分离。
蛋白凝胶染色
SDS-PAGE 后，可以将分离的蛋白质点进行染色和可视化。以下蛋白染料不但灵敏度高，染色方案也快速简单，可兼容下游蛋白质点的切除、胰蛋白酶酶切和质谱分析。
| 蛋白染料 | 灵敏度 | 染色时间 | 其他信息 |
|---|---|---|---|
| SYPRO Ruby | 0.25–1 ng | 90 分钟微波方案 18 小时标准方案 | 荧光染料 Ex: 280, 450nm Em: 610 nm |
| SilverQuest 银染试剂盒 | 0.3 ng | 标准方案：1 小时 30 分钟 微波方案：30 分钟 | 包含的组件 可完全去除： 银离子 |
| SimplyBlue SafeStain 染料 | > 7 ng | 12 分钟微波方案 135 分钟标准方案 | 单一组分– 即用型 |
| Pro-Q Emerald 488 糖蛋白凝胶和印迹染色试剂盒 | 4 ng | 约 6 小时 | Ex: 510 nm Em: 520 nm |
| Pro-Q Emerald 300 糖蛋白凝胶和印迹染色试剂盒 | 0.5 ng | 约 5 小时 | Ex: 280 nm Em: 530 nm 也可使用 300 nm 紫外光照射进行检测 |
| Pro-Q Diamond 磷蛋白凝胶染色试剂盒 | 1-16 ng | 4-5 小时 | Ex: 555 nm Em: 580 nm |
蛋白点也可以转移到印迹膜上用于免疫检测或蛋白测序。
迎新套装
第一向和第二向迎新套装包含 2D 电泳入门所需的所有组件。只需要添加符合您需求的 ZOOM IPG 条带和载体两性电解质。
有关每个迎新套装中产品的完整清单，请见下表：
| 名称 | 组件 | |
|---|---|---|
| 第一向 | PowerEase™ Touch 高压触屏电源和 ZOOM™ IPGRunner™ 迎新套装 | PE Touch 高压触屏电源 ZOOM IPGRunner 小型槽 ZOOM IPGRunner 卡盒 ZOOM 尿素 ZOOM CHAPS ZOOM 平衡托盘 |
| 第二向 | NuPAGE™ Bis-Tris XCell SureLock™ 小型电泳槽迎新套装，4~12%，IPG 孔 | XCell SureLock 小型电泳槽 NuPAGE 4–12% Bis-Tris ZOOM 凝胶 NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X) NuPAGE 样品还原剂 (10X) NuPage MES 电泳缓冲液 (20X) PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准 |
订购
第一向
第二向
蛋白质凝胶染色
技术文档
样品制备
样品制备是所有蛋白质分析工作流程中的基本步骤，但在没有通用方法的 2D 电泳中更为关键。缓冲液通常含有变性剂、尿素或尿素与硫脲的混合物、非离子去污剂或两性离子去污剂、裂解二硫键的还原剂和两性电解质。配制增溶缓冲液的目的是为了达到最佳的蛋白质增溶作用，防止在支持 IPG 胶条的凝胶的水化过程中发生沉淀。盐、离子型分子和离子去垢剂干扰等电聚焦，影响蛋白质分离。下表列出了样品制备的常用试剂。每种组分的浓度需要通过实验确定，实验条件需要优化。这可以通过 ZOOM IPGRunner 系统轻松、快速实现。
| 组分 | 功能 | 浓度 |
|---|---|---|
| 用于膜蛋白的尿素或尿素/硫脲 | 蛋白变性和增溶 | 8 M 或 9 M 尿素或 5–8 M 尿素，含 2 M 硫脲 |
| 非离子去垢剂（CHAPS、CHAPSO、NP-40） | 蛋白增溶和稳定 | 0.5-4% |
| DTT 或 DTE | 还原二硫键 | 20 mM–100 mM |
| 两性电解质 | 帮助蛋白质增溶，维持 pH 梯度 | 0.2-2% |
第一向
ZOOM IPGRunner 系统是一个无需矿物油的平台，可在 3 小时内对多达 12 份样品进行等电聚焦。7 cm ZOOM 胶条是固相化 pH 梯度 (IPG) 凝胶条带，浇铸在塑料支架上。这些胶条可提供用于宽范围分析的宽 pH 梯度形式（3–10、4–7、6–10），以及用于在特定目标区域进行深度蛋白分离的窄 pH 梯度形式（4.5–5.5、5.3–6.3、6.1–7.1）。
范围重叠的 ZOOM IPG 条带有 8 种类型：
| 范围广： | 中范围： | 窄范围： |
|---|---|---|
| pH 3–10 非线性 | pH 6–10 | pH 4.5–5.5 |
| pH 3–10 线性 | pH 9–12 | pH 5.3–6.3 |
| pH 4–7 | pH 6.1–7.1 |
pH 宽范围 IPG 胶条可分离单块凝胶中的大部分蛋白质。非线性 pH 梯度通过扩大凝胶中间的 pH 范围和压缩梯度酸性端和碱性端的 pH 值，提高了大部分蛋白质可能聚焦的 pH 范围中间的蛋白质分辨率。一个单位 pH 范围 IPG 胶条可以简单地“分级分离”样品并提高凝胶分辨能力。在整个凝胶长度上，只分辨出一小部分蛋白质，这可以增加上样量，进而检测更多的蛋白质点。通过运行 pH 范围重叠的 IPG 胶条，提高了整体的分离分辨率，可分析更多蛋白质，无需耗时且影响再现性的样品分级分离步骤。
下表为蛋白上样量建议。
| IPG pH 范围 | 考马斯染色 | 银染 | 上样量 |
|---|---|---|---|
| 宽范围 (3–10 L, NL) | 20–50 μg | 5–15 μg | 过夜水化需 140 μl 或 155 μl |
| 中范围 (6–10, 9–12, 4–7) | 100–200 μg | 50–100 μg | 过夜水化需 140 μl 或 155 μl |
| 窄范围（4.5–5.5、5.3–6.3、6.1–7.1） | 最多 400 μg | 最多 200 μg | 过夜水化需 140 μl 或 155 μl |
ZOOM 载体两性电解质是一种可溶性小分子，带有正负电荷团，基于等电场在其相对位置上进行排序，形成 pH 梯度。载体两性电解质有助于稳定 IPG 胶条中的 pH 梯度和电流，提高蛋白质溶解度，从而提高 IEF 分辨率的再现性。
第二向
等电聚焦后，使用 NuPAGE LDS 样品缓冲液还原、烷基化及平衡 ZOOM 条带。平衡后的 ZOOM IPG 胶条可轻松放入 NuPAGE 凝胶，根据分子量对蛋白质进行二维分离。
蛋白凝胶染色
SDS-PAGE 后，可以将分离的蛋白质点进行染色和可视化。以下蛋白染料不但灵敏度高，染色方案也快速简单，可兼容下游蛋白质点的切除、胰蛋白酶酶切和质谱分析。
| 蛋白染料 | 灵敏度 | 染色时间 | 其他信息 |
|---|---|---|---|
| SYPRO Ruby | 0.25–1 ng | 90 分钟微波方案 18 小时标准方案 | 荧光染料 Ex: 280, 450nm Em: 610 nm |
| SilverQuest 银染试剂盒 | 0.3 ng | 标准方案：1 小时 30 分钟 微波方案：30 分钟 | 包含的组件 可完全去除： 银离子 |
| SimplyBlue SafeStain 染料 | > 7 ng | 12 分钟微波方案 135 分钟标准方案 | 单一组分– 即用型 |
| Pro-Q Emerald 488 糖蛋白凝胶和印迹染色试剂盒 | 4 ng | 约 6 小时 | Ex: 510 nm Em: 520 nm |
| Pro-Q Emerald 300 糖蛋白凝胶和印迹染色试剂盒 | 0.5 ng | 约 5 小时 | Ex: 280 nm Em: 530 nm 也可使用 300 nm 紫外光照射进行检测 |
| Pro-Q Diamond 磷蛋白凝胶染色试剂盒 | 1-16 ng | 4-5 小时 | Ex: 555 nm Em: 580 nm |
蛋白点也可以转移到印迹膜上用于免疫检测或蛋白测序。
迎新套装
第一向和第二向迎新套装包含 2D 电泳入门所需的所有组件。只需要添加符合您需求的 ZOOM IPG 条带和载体两性电解质。
有关每个迎新套装中产品的完整清单，请见下表：
| 名称 | 组件 | |
|---|---|---|
| 第一向 | PowerEase™ Touch 高压触屏电源和 ZOOM™ IPGRunner™ 迎新套装 | PE Touch 高压触屏电源 ZOOM IPGRunner 小型槽 ZOOM IPGRunner 卡盒 ZOOM 尿素 ZOOM CHAPS ZOOM 平衡托盘 |
| 第二向 | NuPAGE™ Bis-Tris XCell SureLock™ 小型电泳槽迎新套装，4~12%，IPG 孔 | XCell SureLock 小型电泳槽 NuPAGE 4–12% Bis-Tris ZOOM 凝胶 NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X) NuPAGE 样品还原剂 (10X) NuPage MES 电泳缓冲液 (20X) PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准 |
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蛋白质凝胶染色
技术文档
参考文献
- Boldt, A, Fortunato, D, Conti, A, Petersen, A, Ballmer-Weber, B, Lepp, U, Reese, G, and Becker, W-M “Analysis of the composition of an immunoglobulin E reactive high molecular weight protein complex of peanut extract containing Ara h 1 and Ara h 3/4” Proteomics 2005 Feb;5(3):675-86.
- Tetlow, IJ, Wait, R, Lu, Z, Akkasaeng, R, Bowsher, CG, Esposito, S, Kosar-Hashemi, B, Morell, MK, and Emes, MJ “Protein Phosphorylation in Amyloplasts Regulates Starch Branching Enzyme Activity and Protein-Protein Interactions” Plant Cell 2004 Mar;16:694-708.
- Zancai P, Dal Col J, Piccinin S, Guidoboni M, Cariati R, Rizzo S, Boiocchi M, Maestro R, Dolcetti R. “Retinoic acid stabilizes p27(Kip1) in EBV-immortalized lymphoblastoid B cell lines through enhanced proteasome-dependent degradation of the p45(Skp2) and Cks1 proteins” Oncogene.2005 Feb 14;
- O’Farrell PH: High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J Biol Chem.1975, 250: 4007-4021.
- Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications.Elsevier Biomedical, Amsterdam.1983
- Righetti, P. G. Immobilized pH Gradients: Theory and Methodology.Elsevier, Amsterdam.1990
Resources
Support
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