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用于 SDS-PAGE 分析的蛋白样本,可通过在上样缓冲液中加热进行变性,上样缓冲液通常含有 1-2% SDS 或 LDS,加入或没加还原剂,如 20mM DTT、2-巯基乙醇 (BME) 或 TCEP。样品缓冲液或上样缓冲液也含有甘油,因此它们比水重,在加入凝胶后能完全沉入浸有缓冲液的上样孔底部。此外,上样缓冲液中还含有带负电荷的低分子量染料,它会在缓冲液前沿迁移,从而可以监控电泳进程。上样缓冲液中最常见的示踪染料是溴酚蓝、酚红和考马斯蓝。下表总结了不同凝胶缓冲液系统中常用的上样缓冲液。
凝胶系统 | 变性上样缓冲液(终浓度) | 电泳样品制备 |
---|---|---|
Tris-甘氨酸 | Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液:Tris HCl (63 mM)、甘油 (10%)、SDS (2%)、溴酚蓝 (0.0025%)、pH 6.8 | 加入上样缓冲液,在 85℃ 下加热样本 2-5 分钟 |
Bis-Tris 体系 | LDS 上样缓冲液:Tris base (141 mM)、Tris Hcl (106 mM)、LDS (2%)、EDTA (0.51 mM)、SERVA Blue G-250 (0.22 mM)、酚红 (0.175 mM)、pH 8.5 | 加入上样缓冲液,在 70℃ 下加热样本 10 分钟 |
Tris-乙酸体系 | LDS 上样缓冲液:Tris base (141 mM)、Tris Hcl (106 mM)、LDS (2%)、EDTA (0.51 mM)、SERVA Blue G-250 (0.22 mM)、酚红 (0.175 mM)、pH 8.5 | 加入上样缓冲液,在 70℃ 下加热样本 10 分钟 |
Tris-Tricine | Tricine SDS 上样缓冲液:Tris Hcl (450 mM)、甘油 (12%)、SDS (4%)、考马斯蓝 G (0.00075%)、酚红 (0.0025%)、pH 8.45 | 加入上样缓冲液,在 85℃ 下加热样本 2-5 分钟 |
酶谱分析(Zymogram) | Tris-甘氨酸 SDS:Tris HCl (63 mM)、甘油 (10%)、SDS (2%)、溴酚蓝 (0.0025%)、pH 6.8 | 不要加热样本,加入样本后立即凝胶上样 |
对于各种荧光应用,我们建议使用不含干扰荧光通道的染料的上样缓冲液(例如,溴酚蓝)。荧光兼容上样缓冲液不含溴酚蓝或其他干扰染料,适用于还原性或非还原性 SDS-PAGE 应用。
如需 SDS 上样缓冲液的配方,可在技术资源标签页中的凝胶产品手册里获取 。 |
用于非变性 PAGE 应用的蛋白样本,应使用不含去垢剂的上样缓冲液制备,以维持蛋白质的天然状态。上样缓冲液含有甘油,因此它们比水重,在加入凝胶后能完全沉入浸有缓冲液的上样孔底部此外,上样缓冲液中还含有带负电荷的低分子量染料,它会在缓冲液前沿迁移,从而可以监控电泳进程。
当制备用于非变性分析应用的样本时,蛋白样本不应进行加热,并应在与样品缓冲液混合后立即加载到凝胶上。
凝胶系统 | 非变性上样缓冲液(最终浓度) |
---|---|
Tris-甘氨酸 | 非变性上样缓冲液:Tris HCl (100mM)、甘油 (10%)、溴酚蓝 (0.00025%)、pH 8.6 |
Tris-乙酸 | 非变性上样缓冲液:Tris HCl (100mM)、甘油 (10%)、溴酚蓝 (0.00025%)、pH 8.6 |
等电聚焦(IEF) | IEF 上样缓冲液 pH 3-7:赖氨酸 (40mM)、甘油 (15%) IEF 上样缓冲液 pH 3-10:精氨酸 (20mM)、赖氨酸 (20mM)、甘油 (15%) |
NativePAGE Bis-Tris | NativePAGE 上样缓冲液 (4X):Bis-Tris (50mM)、6 N HCl、NaCl (50mM)、甘油 (10%)、胭脂红 S (0.001%)、pH 7.2 |
如需非变性上样缓冲液的配方,可在技术资源标签页中的凝胶产品手册里获取。 |
在蛋白电泳(不连续缓冲液系统)中,凝胶中的一级阴离子与电泳缓冲液中的一级阴离子不同(或不连续)。下表为不同凝胶缓冲系统推荐了相应的 SDS 电泳缓冲液或非变性电泳缓冲液。
凝胶系统 | SDS 电泳缓冲液 |
---|---|
Tris-甘氨酸 | Tris-甘氨酸 SDS:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、SDS (0.1%)、pH 8.3 |
Bis-Tris 体系 | MES SDS:MES (50mM)、Tris base (50mM)、SDS (0.1%)、EDTA (1mM)、pH 7.3 MOPS SDS:MOPS (50mM)、Tris base (50mM)、SDS (0.1%)、EDTA (1mM)、pH 7.7 |
Tris-乙酸 | Tris-乙酸 SDS:Tris base (50mM)、Tricine (50mM)、SDS (0.1%)、pH 8.24 |
Tris-tricine | Tricine-SDS:Tris base (100mM)、Tricine (100mM)、SDS (0.1%)、pH 8.3 |
凝胶系统 | 非变性电泳缓冲液 |
---|---|
Tris-甘氨酸 | Tris-甘氨酸非变性缓冲液:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、pH 8.3 |
Tris-乙酸 | Tris-甘氨酸非变性缓冲液:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、pH 8.3 |
等电聚焦(IEF) | IEF 阴极缓冲液 pH 3-7:赖氨酸 (40mM) IEF 阴极缓冲液 pH 3-10:精氨酸 (20mM)、赖氨酸 (20mM) IEF 阳极缓冲液:磷酸 85% (7 mM) |
酶谱分析(Zymogram) | Tris-甘氨酸 SDS:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、SDS (0.1%)、pH 8.3 |
如需SDS 电泳缓冲液或非变性电泳缓冲液的配方,可在技术资源标签页中的凝胶产品手册里获取。 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
---|---|---|---|---|
宽范围分子量 (6-400kDa) | Bis-tris | 变性:LDS 上样缓冲液 还原:样本还原剂 | 低至中分子量蛋白 (6–260kDa):MES SDS 缓冲液 中至高分子量蛋白 (14–260kDa):MOPS SDS 缓冲液 还原型样品:抗氧化剂 | Bis-tris 转印缓冲液 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
---|---|---|---|---|
宽范围分子量 (6-400kDa) | Bis-tris | 变性:LDS 上样缓冲液 还原:样本还原剂 | 低至中分子量蛋白 (6–260kDa):MES SDS 缓冲液 中至高分子量蛋白 (14–260kDa):MOPS SDS 缓冲液 还原型样品:抗氧化剂 | Bis-tris 转印缓冲液 |
Bolt 和NuPAGE LDS 上样缓冲液是使用考马斯 G250 和酚红代替溴酚蓝作为示踪染料来配制的。考马斯 (SERVA) G250 在 MES 和 MOPS SDS 电泳缓冲液中均可显示出清晰的染料前沿,并且比溴酚蓝更靠近移动的离子迁移前沿。而溴酚蓝在 MES SDS 电泳缓冲液中的迁移速度会比某些肽段慢。这确保了小的肽段不会从凝胶中跑出。在 Bolt 和 NuPAGE LDS 上样缓冲液中,示踪染料(考马斯 G250)的浓度增加,以便于对染料前沿的观察。通过使用 LDS 替代 SDS 可配制 4 X 溶液。4X 溶液可让样本中的的蛋白浓度更高,避免蛋白样本过于稀释。
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
---|---|---|---|---|
宽范围分子量 (6-400kDa) | Tris-甘氨酸 | 变性:Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液 | 变性:Tris-甘氨酸 SDS 缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性缓冲液 | Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
---|---|---|---|---|
高分子量 (40-500kDa) | Tris-乙酸 | 变性:LDS 上样缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液 | 变性:Tris-乙酸 SDS 缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性缓冲液 | Bis-tris 转印缓冲液 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
---|---|---|---|---|
低分子量 (2.5-40kDa) | Tricine 体系 | 变性:Tricine SDS 上样缓冲液 | Tricine SDS 缓冲液 | Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
凝胶类型 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 凝胶显影缓冲液 | 凝胶复性缓冲液 |
---|---|---|---|---|
酶谱凝胶 | Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液 | Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 | 酶谱显影缓冲液 | 酶谱复性缓冲液 |
在手工制备聚丙烯酰胺凝胶时,选择高质量的制胶试剂可以帮助获得更好的电泳结果。SureCast 缓冲液和试剂可让制备高质量的 Tris-甘氨酸手灌胶更为快速简单。
根据下表中的体积准备分离胶溶液。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量,成比例放大体积。
聚丙烯酰胺浓度% | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
溶液 | 4% | 6% | 8% | 10% | 12% | 14% | 16% | 18% | 20% |
SureCast 丙烯酰胺 (40%) | 0.8mL | 1.2mL | 1.6mL | 2.0 mL | 2.4mL | 2.8mL | 3.3mL | 3.6mL | 4.0mL |
SureCast 分离胶缓冲液 | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL |
蒸馏水 | 5.1mL | 4.7mL | 4.3mL | 3.9mL | 3.5mL | 3.1mL | 2.7mL | 2.3mL | 1.9mL |
10% SureCast 过硫酸铵 (APS) | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL |
SureCast TEMED** | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL |
**最后加入并在倒胶之前将其充分混匀
根据下表中的体积准备浓缩胶溶液。表中所列的体积适用于制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量,成比例放大体积。备注:溶液无需排气。
溶液 | 4% |
---|---|
SureCast 丙烯酰胺 (40%) | 0.30 mL |
SureCast 浓缩胶缓冲液 | 0.75 mL |
蒸馏水 | 1.92 mL |
10% SureCast 过硫酸铵 (APS) | 30 µL |
SureCast TEMED*** | 3 µL |
***最后加入并在倒胶之前将其充分混匀
了解关于SureCast手灌胶系统的信息,并获取更多SDS-PAGE 制胶试剂的配方。 |
用于 SDS-PAGE 分析的蛋白样本,可通过在上样缓冲液中加热进行变性,上样缓冲液通常含有 1-2% SDS 或 LDS,加入或没加还原剂,如 20mM DTT、2-巯基乙醇 (BME) 或 TCEP。样品缓冲液或上样缓冲液也含有甘油,因此它们比水重,在加入凝胶后能完全沉入浸有缓冲液的上样孔底部。此外,上样缓冲液中还含有带负电荷的低分子量染料,它会在缓冲液前沿迁移,从而可以监控电泳进程。上样缓冲液中最常见的示踪染料是溴酚蓝、酚红和考马斯蓝。下表总结了不同凝胶缓冲液系统中常用的上样缓冲液。
凝胶系统 | 变性上样缓冲液(终浓度) | 电泳样品制备 |
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Tris-甘氨酸 | Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液:Tris HCl (63 mM)、甘油 (10%)、SDS (2%)、溴酚蓝 (0.0025%)、pH 6.8 | 加入上样缓冲液,在 85℃ 下加热样本 2-5 分钟 |
Bis-Tris 体系 | LDS 上样缓冲液:Tris base (141 mM)、Tris Hcl (106 mM)、LDS (2%)、EDTA (0.51 mM)、SERVA Blue G-250 (0.22 mM)、酚红 (0.175 mM)、pH 8.5 | 加入上样缓冲液,在 70℃ 下加热样本 10 分钟 |
Tris-乙酸体系 | LDS 上样缓冲液:Tris base (141 mM)、Tris Hcl (106 mM)、LDS (2%)、EDTA (0.51 mM)、SERVA Blue G-250 (0.22 mM)、酚红 (0.175 mM)、pH 8.5 | 加入上样缓冲液,在 70℃ 下加热样本 10 分钟 |
Tris-Tricine | Tricine SDS 上样缓冲液:Tris Hcl (450 mM)、甘油 (12%)、SDS (4%)、考马斯蓝 G (0.00075%)、酚红 (0.0025%)、pH 8.45 | 加入上样缓冲液,在 85℃ 下加热样本 2-5 分钟 |
酶谱分析(Zymogram) | Tris-甘氨酸 SDS:Tris HCl (63 mM)、甘油 (10%)、SDS (2%)、溴酚蓝 (0.0025%)、pH 6.8 | 不要加热样本,加入样本后立即凝胶上样 |
对于各种荧光应用,我们建议使用不含干扰荧光通道的染料的上样缓冲液(例如,溴酚蓝)。荧光兼容上样缓冲液不含溴酚蓝或其他干扰染料,适用于还原性或非还原性 SDS-PAGE 应用。
如需 SDS 上样缓冲液的配方,可在技术资源标签页中的凝胶产品手册里获取 。 |
用于非变性 PAGE 应用的蛋白样本,应使用不含去垢剂的上样缓冲液制备,以维持蛋白质的天然状态。上样缓冲液含有甘油,因此它们比水重,在加入凝胶后能完全沉入浸有缓冲液的上样孔底部此外,上样缓冲液中还含有带负电荷的低分子量染料,它会在缓冲液前沿迁移,从而可以监控电泳进程。
当制备用于非变性分析应用的样本时,蛋白样本不应进行加热,并应在与样品缓冲液混合后立即加载到凝胶上。
凝胶系统 | 非变性上样缓冲液(最终浓度) |
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Tris-甘氨酸 | 非变性上样缓冲液:Tris HCl (100mM)、甘油 (10%)、溴酚蓝 (0.00025%)、pH 8.6 |
Tris-乙酸 | 非变性上样缓冲液:Tris HCl (100mM)、甘油 (10%)、溴酚蓝 (0.00025%)、pH 8.6 |
等电聚焦(IEF) | IEF 上样缓冲液 pH 3-7:赖氨酸 (40mM)、甘油 (15%) IEF 上样缓冲液 pH 3-10:精氨酸 (20mM)、赖氨酸 (20mM)、甘油 (15%) |
NativePAGE Bis-Tris | NativePAGE 上样缓冲液 (4X):Bis-Tris (50mM)、6 N HCl、NaCl (50mM)、甘油 (10%)、胭脂红 S (0.001%)、pH 7.2 |
如需非变性上样缓冲液的配方,可在技术资源标签页中的凝胶产品手册里获取。 |
在蛋白电泳(不连续缓冲液系统)中,凝胶中的一级阴离子与电泳缓冲液中的一级阴离子不同(或不连续)。下表为不同凝胶缓冲系统推荐了相应的 SDS 电泳缓冲液或非变性电泳缓冲液。
凝胶系统 | SDS 电泳缓冲液 |
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Tris-甘氨酸 | Tris-甘氨酸 SDS:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、SDS (0.1%)、pH 8.3 |
Bis-Tris 体系 | MES SDS:MES (50mM)、Tris base (50mM)、SDS (0.1%)、EDTA (1mM)、pH 7.3 MOPS SDS:MOPS (50mM)、Tris base (50mM)、SDS (0.1%)、EDTA (1mM)、pH 7.7 |
Tris-乙酸 | Tris-乙酸 SDS:Tris base (50mM)、Tricine (50mM)、SDS (0.1%)、pH 8.24 |
Tris-tricine | Tricine-SDS:Tris base (100mM)、Tricine (100mM)、SDS (0.1%)、pH 8.3 |
凝胶系统 | 非变性电泳缓冲液 |
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Tris-甘氨酸 | Tris-甘氨酸非变性缓冲液:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、pH 8.3 |
Tris-乙酸 | Tris-甘氨酸非变性缓冲液:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、pH 8.3 |
等电聚焦(IEF) | IEF 阴极缓冲液 pH 3-7:赖氨酸 (40mM) IEF 阴极缓冲液 pH 3-10:精氨酸 (20mM)、赖氨酸 (20mM) IEF 阳极缓冲液:磷酸 85% (7 mM) |
酶谱分析(Zymogram) | Tris-甘氨酸 SDS:Tris base (25mM)、甘氨酸 (192mM)、SDS (0.1%)、pH 8.3 |
如需SDS 电泳缓冲液或非变性电泳缓冲液的配方,可在技术资源标签页中的凝胶产品手册里获取。 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
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宽范围分子量 (6-400kDa) | Bis-tris | 变性:LDS 上样缓冲液 还原:样本还原剂 | 低至中分子量蛋白 (6–260kDa):MES SDS 缓冲液 中至高分子量蛋白 (14–260kDa):MOPS SDS 缓冲液 还原型样品:抗氧化剂 | Bis-tris 转印缓冲液 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
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宽范围分子量 (6-400kDa) | Bis-tris | 变性:LDS 上样缓冲液 还原:样本还原剂 | 低至中分子量蛋白 (6–260kDa):MES SDS 缓冲液 中至高分子量蛋白 (14–260kDa):MOPS SDS 缓冲液 还原型样品:抗氧化剂 | Bis-tris 转印缓冲液 |
Bolt 和NuPAGE LDS 上样缓冲液是使用考马斯 G250 和酚红代替溴酚蓝作为示踪染料来配制的。考马斯 (SERVA) G250 在 MES 和 MOPS SDS 电泳缓冲液中均可显示出清晰的染料前沿,并且比溴酚蓝更靠近移动的离子迁移前沿。而溴酚蓝在 MES SDS 电泳缓冲液中的迁移速度会比某些肽段慢。这确保了小的肽段不会从凝胶中跑出。在 Bolt 和 NuPAGE LDS 上样缓冲液中,示踪染料(考马斯 G250)的浓度增加,以便于对染料前沿的观察。通过使用 LDS 替代 SDS 可配制 4 X 溶液。4X 溶液可让样本中的的蛋白浓度更高,避免蛋白样本过于稀释。
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
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宽范围分子量 (6-400kDa) | Tris-甘氨酸 | 变性:Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液 | 变性:Tris-甘氨酸 SDS 缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性缓冲液 | Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
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高分子量 (40-500kDa) | Tris-乙酸 | 变性:LDS 上样缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性上样缓冲液 | 变性:Tris-乙酸 SDS 缓冲液 非变性:Tris-甘氨酸非变性缓冲液 | Bis-tris 转印缓冲液 |
蛋白样本 | 凝胶体系 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
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低分子量 (2.5-40kDa) | Tricine 体系 | 变性:Tricine SDS 上样缓冲液 | Tricine SDS 缓冲液 | Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
凝胶类型 | 上样缓冲液 | 电泳缓冲液 | 凝胶显影缓冲液 | 凝胶复性缓冲液 |
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酶谱凝胶 | Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液 | Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 | 酶谱显影缓冲液 | 酶谱复性缓冲液 |
在手工制备聚丙烯酰胺凝胶时,选择高质量的制胶试剂可以帮助获得更好的电泳结果。SureCast 缓冲液和试剂可让制备高质量的 Tris-甘氨酸手灌胶更为快速简单。
根据下表中的体积准备分离胶溶液。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量,成比例放大体积。
聚丙烯酰胺浓度% | |||||||||
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溶液 | 4% | 6% | 8% | 10% | 12% | 14% | 16% | 18% | 20% |
SureCast 丙烯酰胺 (40%) | 0.8mL | 1.2mL | 1.6mL | 2.0 mL | 2.4mL | 2.8mL | 3.3mL | 3.6mL | 4.0mL |
SureCast 分离胶缓冲液 | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL | 2.0 mL |
蒸馏水 | 5.1mL | 4.7mL | 4.3mL | 3.9mL | 3.5mL | 3.1mL | 2.7mL | 2.3mL | 1.9mL |
10% SureCast 过硫酸铵 (APS) | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL | 80µL |
SureCast TEMED** | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL | 8µL |
**最后加入并在倒胶之前将其充分混匀
根据下表中的体积准备浓缩胶溶液。表中所列的体积适用于制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量,成比例放大体积。备注:溶液无需排气。
溶液 | 4% |
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SureCast 丙烯酰胺 (40%) | 0.30 mL |
SureCast 浓缩胶缓冲液 | 0.75 mL |
蒸馏水 | 1.92 mL |
10% SureCast 过硫酸铵 (APS) | 30 µL |
SureCast TEMED*** | 3 µL |
***最后加入并在倒胶之前将其充分混匀
了解关于SureCast手灌胶系统的信息,并获取更多SDS-PAGE 制胶试剂的配方。 |
仅供科研使用,不可用于诊断目的。