内毒素检测方法概述

Thermo Scientific Pierce 快速凝胶法内毒素测定试剂盒能快速得到定性结果且易于读取，所得结果能表明样本中是否存在革兰氏阴性菌内毒素。该试剂盒用于体外终点内毒素检测，无需复杂的设备或软件。此类试剂盒适合有色样本，且具有多种灵敏度：0.03 EU/mL、0.125 EU/mL、0.25 EU/mL 和 0.5 EU/mL。

Pierce 快速凝胶凝块法内毒素测定试剂盒使用来源于鲎血淋巴的鲎细胞裂解物来检测样本中的内毒素水平。鲎试剂 (LAL) 作为一种简单、灵敏的检测革兰氏阴性菌细胞膜内毒素脂多糖的方法，已被广泛应用。当内毒素与鲎试剂相遇时，会发生一系列酶促反应，从而形成凝胶样凝块。检测结果呈阳性时，样本管中会形成凝块，表明样本中的内毒素含量大于或等于试剂盒列出的灵敏度（单位：EU/mL）。如果试管中未形成凝胶，则认为结果为阴性，表明试管中的内毒素浓度低于试剂盒的灵敏度（图3）。

新型  Pierce 快速凝胶凝块法内毒素测定试剂盒

Thermo Scientific Pierce 显色内毒素定量试剂盒可准确测定样本中低至 0.01 EU/mL 的内毒素。该试剂盒是一种终点鲎试剂测定试剂盒，可准确检测和定量多种样本类型中的内毒素（脂多糖），包括蛋白质、多肽、核酸和抗体。

该测定的原理是，在存在内毒素的情况下，会激活鲎试剂中的因子 C、因子 B 和促凝血酶。通过加入显色底物 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA 来定量测定内毒素含量。内毒素激活的促凝血酶能催化对硝基苯胺 (pNA) 的释放，从而产生黄色（图4）。

图4.鲎血液中的凝血级联反应。 LPS（内毒素）能激活质膜结合因子 C。活化的因子 C 可激活因子 B，后者会激活凝固酶，触发凝血级联反应的胞外释放。加入显色底物后，Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（活化的蛋白质酶，凝固酶）催化对硝基苯胺 (pNA) 的释放，从而产生黄色，可通过测量 405 nm 处的吸光度并从标准曲线外推来得出定量结果。

反应停止后，在 405 nm 处采用光度法测定释放的 pNA（图5）。显色强度与样本中存在的内毒素量成正比，并使用标准曲线计算。

由于细胞培养和动物研究的样本局限性以及所要求的较低内毒素水平，灵敏的内毒素检测就至关重要。Pierce 显色内毒素定量试剂盒具有较高的灵敏度和重现性，提供 0.01–0.1 EU/mL 和 0.1–1.0 EU/mL 两个线性动态范围（图6）。使用该终点鲎试剂测定试剂盒的试验间和操作者间的重现性变异系数 (CV) 为 3%。灵敏度范围较低时，能对数量有限或含有干扰物质的样本进行更高倍数的稀释，因此有助于避免内毒素定量中潜在的假阴性或假阳性。

图6.Pierce 显色内毒素定量试剂盒的标准曲线。标准曲线呈现出出色的线性，r2 = 0.99。Pierce 显色内毒素定量试剂盒的较低标准曲线范围为 0.01–0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL 标准曲线表示使用内毒素标准品和鲎试剂培养14分钟，随后使用显色底物培养6分钟。对于较低浓度范围，使用内毒素标准品和鲎试剂培养30分钟，随后使用显色底物培养6分钟。低浓度范围标准品 (0.01–0.1 EU/mL) 的检测呈现出一致性和重现性（n = 17；CV = 3%）。

鲎试剂测定可能受诸多因素的影响，这些因素可能引起抑制或增强，产生假阴性或假阳性结果。可能导致抑制鲎试剂测定的因素包括反应温度、样本 pH 值、离子强度和金属离子（例如镁和钙）。血清蛋白质、核酸和脂肪酸、表面活性剂和螯合试剂（例如 EDTA 和肝素）会引起内毒素聚集体分子结构变化，可能导致不准确的鲎试剂测定或测定失效。此外，各种蛋白质工作流程中使用的表面活性剂（如 Triton X-100、SDS、脱氧胆酸盐）会改变脂多糖的超分子结构，因此会干扰其检测和定量。如果受试样本中存在这些干扰物质中的任何一种，则需要稀释样本。

表1总结了常用试剂与鲎试剂测定的兼容性水平。加入样本中的内毒素的测定浓度必须在已知加入量的 50%-200% 范围内，方可认为检测中不存在干扰因素。

鲎试剂测定中另一种常见的干扰物质是细菌和真菌的细胞壁成分 (1,3)-β-D-葡聚糖。虽然β-葡聚糖不具热原性，但可激活因子 G，从而能够触发凝血级联反应，在测定中产生假阳性结果（图7）。Pierce 显色内毒素定量试剂盒与β-葡聚糖兼容，在含 ≤10 ng/mL (1,3)-β-D-葡聚糖的样本中，未显示增强。

图7.(1,3)-β-D-葡聚糖激活凝固酶。当存在β-葡聚糖时，会激活一种与鲎试剂对内毒素的反应无关的途径，导致样本的细菌内毒素测定结果呈假阳性。Pierce 显色内毒素定量试剂盒对β-葡聚糖具有抗性。红色表示无活性酶，绿色表示活性酶。

Pierce 显色内毒素定量试剂盒

将被内毒素污染的蛋白质或抗体样本转染到细胞中或注射到动物宿主中，可引发强烈的免疫反应，导致全身性炎症反应综合征 (SIRS) 和/或败血症。在细胞转染或动物注射前，有必要去除样本中革兰氏阴性菌产生的内毒素。传统使用超滤、多粘菌素 B 亲和树脂或者基于树脂或膜的色谱法来去除内毒素。这些方法在蛋白质回收率或内毒素结合能力方面存在局限性，或者存在毒性问题。

Pierce 高容量内毒素去除树脂是一种经改良的 ε-聚赖氨酸 [聚（ε-赖氨酸）] 亲和树脂（天然氨基酸赖氨酸的无毒聚合物），展示出了优异的内毒素结合能力和蛋白质回收率。可有效去除含有各种来源、大小和电荷的蛋白质的样本中的内毒素。该树脂的结合能力较高，蛋白质保留能力较低，故适用于多种蛋白质样本类型（包括抗体）。

图8 展示了 Pierce 高容量内毒素去除树脂上的聚（ε-赖氨酸）亲和配体如何通过阳离子和疏水性相互作用结合内毒素。

Pierce 高容量内毒素去除树脂的结合能力为 2,000,000 EU/mL，能使初始内毒素水平为 10,000 EU/mL 的样本中的内毒素水平降低达 99%。采用 Thermo Scientific Pierce 高容量内毒素去除树脂处理的典型蛋白质样本的最终内毒素浓度低于 5 EU/mL（图9）。

Pierce 高容量内毒素去除树脂

Invitrogen Qubit 内毒素检测测定试剂盒和 Invitrogen Quant‑iT 内毒素检测测定试剂盒，分别设计为与 Invitrogen Qubit Flex 荧光计和荧光酶标仪配合使用，提供高效的荧光终点测定，采用简化的工作流程定量各种样本类型中的内毒素。

Qubit 内毒素检测测定试剂盒旨在与 Qubit Flex 荧光计配合使用，是一种高效的荧光终点测定试剂盒，使用鲎试剂来定量蛋白质、多肽、抗体或核酸样本等多种样本类型中的内毒素。可以使用不同的样品量进行此测定，通过简化的工作流程实现 0.01-10.0 EU/mL 的动态范围（图10）。

Qubit 内毒素检测测定试剂盒的主要特点和优势包括：

• 灵敏度高及范围广 - 可检测低至 0.01 EU/mL 至 10.0 EU/mL 的样品量水平
• 适用于多种样品 - 包括蛋白质、质粒制备物、DNA 和 RNA
• 易于使用 - 与 Qubit Flex 荧光计配合使用时，自动执行计算，减少出错的可能性

新型 Invitrogen Quant-iT™ 内毒素检测测定试剂盒
Quant-iT 内毒素检测测定试剂盒旨在与荧光酶标仪配合使用，提供高效的荧光终点测定，使用鲎试剂来定量蛋白质、多肽、抗体或核酸样本等多种样本类型中的内毒素。该测定试剂盒可在不同的样本量上执行测定，并采用简化的工作流程实现 0.01-10.0 EU/mL 的动态范围（图11）。