介绍

脂多糖（LPS）是免疫细胞（包括B细胞，单核细胞，巨噬细胞和其他LPS反应性细胞）的强活化剂。这些免疫细胞需要 LPS 等免疫原性刺激物，才能产生细胞因子。例如，由 LPS 活化的单核细胞能分泌白细胞介素-6（IL-6）、IL-10或 TNF-α。 LPS 刺激免疫细胞的方案如下。


材料

  1. 带过滤器的 T25 或 T75 无菌烧瓶（例如 Nunc EasYFlask 细胞培养瓶，T25，过滤，货号：156367）
  2. RPMI 1640 培养基（例如 BenchStable RPMI 1640 培养基，货号：A4192301）
  3. 胎牛血清（例如 Gibco 胎牛血清，货号：26140087，或小包装牛血清）
  4. 左旋谷氨酰胺（例如 200 mM 左旋谷氨酰胺，货号：25030149）
  5. 可选：青霉素-链霉素（例如 Gibco 青霉素-链霉素，货号：15140148）
  6. 脂多糖（LPS）（例如 eBioscience 脂多糖溶液，货号：00-4976-93）
  7. 细胞刮刀（例如 Nunc 细胞刮刀，货号：179693）


步骤

  1. 在无菌条件下，从全血或淋巴组织中分离免疫细胞（分别见下面的补充方案 A 或 B）。
  1. 制备 RPMI 1640 完全培养基：添加胎牛血清（最终浓度达 10%）和 2 mM 左旋谷氨酰胺到RPMI 1640 培养基（如果使用不含 GlutaMAX 的培养基）。使培养基的温度达到 37°C。 可选：添加 1% 的青霉素-链霉素到培养基（5000 单位/mL）中。
  1. 用RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，使细胞浓度达 3 x 106 个细胞/mL。根据的培养瓶（T25 或 T75）大小，制备所需的体积。
  1. 准备两个培养瓶：一个贴有“已刺激”（已活化）标签，另一个贴有“未刺激”（未活化）标签。
  1. 将细胞溶液（在步骤 3 中制备）平均分至两个培养瓶中。
  1. 向已刺激（已活化）培养瓶加入浓度为 1X (2 µL/mL) 的脂多糖（LPS）。盖上盖子。
  1. 在 37°C ， 5% CO2 的培养箱中培养 1-3 天。
  1. 用细胞刮刀收集细胞。

方案提示：

可以使用单核细胞富集试剂盒（例如， MagniSort人类泛单核细胞富集试剂盒，货号：30）通过阴性选择从PBMC富集单核细胞。货号：8804-6837-74）。


补充方案 A：从全血中分离 PBMC

材料

  1. 磷酸盐缓冲液（例如 Gibco PBS (10X)，pH 7.4，货号：70011044）
  2. 15 mL 或 50 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管，货号：339650）
  3. Ficoll-Paque® 密度分离培养基
  4. 流式染色缓冲液（例如 eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）

步骤

  1. 在锥形管中，按至少 1:1 的比例使用 PBS 稀释血液样本。
  1. 往稀释的样本中加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque® 。
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管加入 PBS，洗涤细胞。
  1. 在 2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟，丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心，并用适量的RPMI 1640 完全培养基重悬，使细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

注意：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示：

使用自动计数仪显著提高了单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数， 见详细方案。

补充方案 B: 从淋巴组织中分离免疫细胞因子

材料

  1. 60 x 15 mm 细胞培养皿（例如 Nunc 皮氏细胞培养皿，货号：150340）
  2. 3 mL 塑料注射器或两个带毛玻璃的载玻片
  3. 细胞筛网（尼龙网）
  4. 15 mL 或 50 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管，货号：339650）
  5. 流式染色缓冲液（例如 eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）

步骤

  1. 将组织（脾脏、胸腺、淋巴结）收集至含有 10 mL 流式染色缓冲液或专用缓冲液的细胞培养皿中。使用 3 mL 注射器柱塞按压组织，使其分离成单细胞悬液。或者使用 10 mL 流式染色缓冲液，将组织置于两个载玻片的磨砂面之间磨碎。
  1. 将细胞筛网放在 15 mL 锥形管顶部。转移细胞通过细胞筛网上，以去除细胞团块和碎片。
  1. 在 2-8°C 下 300-400 x g 离心 4-5 分钟。丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤3对细胞进行离心， 然后用适量RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

备注：

一般来说，机械性破坏淋巴组织足以制备单个细胞悬液。

备注：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。